晚期蛋白氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)人單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子及其機(jī)制研究.pdf

1、我們以AOPP修飾的牛血清白蛋白作為AOPP模型,研究了AOPP對(duì)單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子的影響及其可能機(jī)制.方法3我們以單核細(xì)胞株THP-1和正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)為效應(yīng)細(xì)胞,觀察AOPP-BSA對(duì)單核細(xì)胞分泌TNF α的影響,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討.一、無(wú)內(nèi)毒素AOPP-BSA的體外制備:采用Witko-Sarsat等介紹的方法.將BSA與次氯酸分別以1/70、1/140和1/280的摩爾比例混合,室溫反應(yīng)30min,制備出

2、三種不同修飾程度的AOPP-BSA.制備的AOPP-BSA在PBS中透析,以除去游離的次氯酸.AOPP含量的測(cè)定:酸性條件下340nm的光吸收,以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn).二、正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離:采用密度梯度離心法.將抗凝全血與6％葡聚糖按5:1混勻,37℃靜置60min,把血漿層輕鋪在淋巴細(xì)胞分離液(相對(duì)密度1.077)上,室溫下以500g/min離心20min,取中間云霧層細(xì)胞,用D-Hank液清洗后,于5%CO2孵箱中培養(yǎng)

3、2小時(shí)后用D-Hank液清洗以除去未貼壁細(xì)胞,將貼壁細(xì)胞消化收集,經(jīng)抗CD68抗體染色鑒定,苔盼藍(lán)拒染試驗(yàn)證實(shí)為活細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度備用.三、人單核細(xì)胞株THP-1的培養(yǎng):復(fù)蘇THP-1細(xì)胞株,懸浮培養(yǎng)于含10%(V/V)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中.四、TNF α的測(cè)定:ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清和用不同抑制劑預(yù)處理后培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子TNF α.采用深圳晶美公司分裝的進(jìn)口雙抗體夾心ELISATNFα檢測(cè)試劑盒.按說(shuō)明操作.五、細(xì)