腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)人口腔鱗癌細胞中C-C趨化因子2表達的分子機制.pdf

1、研究目的：
　　CCL2是重要的促炎細胞因子，對單核/巨噬細胞具有特異性趨化激活作用，參與口腔癌的發(fā)生及發(fā)展。TNF-α是一種主要由巨噬細胞分泌并參與炎癥反應(yīng)的細胞因子，能誘導(dǎo)包括CCL2在內(nèi)的各種炎癥相關(guān)因子的表達。但TNF-α誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞CCL2基因表達的分子機制未知。由于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合狀態(tài)及組蛋白修飾密切相關(guān)。本研究擬通過研究人口腔鱗癌細胞中CCL2基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合水平及組蛋白乙?；?/p>

2、、甲基化修飾水平，來探討TNFα誘導(dǎo)CCL2高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為進一步探究CCL2在口腔鱗癌中表達的分子機制奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　培養(yǎng)人口腔鱗癌細胞，用TNFα（10μg/L）刺激，利用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中CCL2的蛋白表達；提取細胞裂解液中總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實時定量PCR檢測CCL2 mRNA表達水平；采用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chip）技術(shù)檢測在TNFα誘導(dǎo)下CCL2啟動子區(qū)組蛋白H

3、3R17甲基化水平、H3和H4的乙?；?、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶CARM1、組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶p300、CBP以及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1與CCL2啟動子結(jié)合情況；Western Blot檢測NF-κB p65胞漿胞核分布情況以及組蛋白H3、H4乙酰化水平。用小分子 RNA阻斷CARM1，并檢測其對 CCL2啟動子區(qū) NF-kB、p-NF-kB、CARM1、H3R17me2a、CBP以及組蛋白H3、H4乙?；降挠绊?。
　　研究

4、結(jié)果：
　　1、 TNFα可誘導(dǎo)人口腔鱗癌細胞中CCL2 mRNA和蛋白的表達。
　　2、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶CARM1介導(dǎo)的CCL2啟動子區(qū)H3R17甲基化水平升高參與TNFα誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞CCL2表達。
　　3、通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，TNFα能誘導(dǎo)人口腔鱗癌細胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-kB（p65）、AP-1（c-jun）與 CCL2啟動子區(qū)結(jié)合增加。siRNA沉默 CARM1后，TNFα誘導(dǎo)的NF-kB（p65）、

5、p-NF-kB與CCL2啟動子結(jié)合顯著下降。
　　4、染色質(zhì)免疫沉淀檢測到 TNFα誘導(dǎo)的 CCL2啟動子區(qū)組蛋白乙?；揭约敖M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶p300/CBP結(jié)合量升高。轉(zhuǎn)染siRNA沉默CARM1后，組蛋白乙?；鞍妆磉_水平顯著降低，同時CCL2啟動子區(qū)組蛋白乙酰化水平降低，CBP與CCL2啟動子結(jié)合顯著下降。
　　研究結(jié)論：
　　TNFα可通過介導(dǎo)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶CARM1與CCL2啟動子區(qū)結(jié)合增加從而誘導(dǎo)人口