人單核細(xì)胞表面晚期氧化蛋白產(chǎn)物結(jié)合蛋白的分離.pdf

1、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advancedoxidationproteinproducts，AOPP)是Witko—Sarsat等于1996年首先報(bào)道的由尿毒癥血液透析患者血漿中分離出的含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，系因患者體內(nèi)過(guò)高的氧化應(yīng)激水平導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)氧化損傷所形成的終末產(chǎn)物的總稱。AOPP隨著慢性腎功能衰竭(Chronicrenalfailure，CRF)及氧化應(yīng)激的進(jìn)展，在患者的循環(huán)和組織中潴留，是一類新的尿毒癥毒素。現(xiàn)已明確，AOP

2、P是一種炎癥介質(zhì)，單核/巨噬細(xì)胞是其選擇性作用的靶細(xì)胞。AOPP能夠激活單核細(xì)胞，刺激TNF-α、IL-6、IL-1等炎性因子的合成釋放，促發(fā)細(xì)胞的炎癥效應(yīng)，參與CRF患者全身微炎癥狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展，是CRF免疫功能紊亂、加速性動(dòng)脈粥樣硬化、透析相關(guān)性淀粉樣變等長(zhǎng)期并發(fā)癥的重要致病環(huán)節(jié)。然而，AOPP一旦形成即不可逆，并且是高分子量蛋白聚合物，血液透析的清除效果極其有限，使得目前在針對(duì)AOPP的治療上存在很大的局限性。因而由其作用途徑入手

3、，尋找干預(yù)靶點(diǎn)，阻斷其毒性作用，并在此基礎(chǔ)上篩選合適的藥物或設(shè)計(jì)新的清除方式應(yīng)是針對(duì)AOPP治療的發(fā)展方向。因此，對(duì)AOPP作用途徑和機(jī)理的研究顯得尤為迫切和重要。 迄今為止，我們對(duì)AOPP發(fā)生作用的途徑和機(jī)理尚不清楚?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，AOPP與另外一種同屬化學(xué)修飾蛋白的尿毒癥毒素—晚期糖基化終產(chǎn)物(Advancedglycationendproducts，AGE)在形成、結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)作用上極其相似，兩者關(guān)系非常密切。AGE是蛋

4、白質(zhì)非酶糖化氧化的終產(chǎn)物，也是一種炎癥介質(zhì)，通過(guò)細(xì)胞表面的幾種AGE結(jié)合蛋白發(fā)揮作用，其中認(rèn)識(shí)最清楚的是AGE受體(Receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE)，主要分布于單核/巨噬細(xì)胞表面。因此我們推測(cè)：?jiǎn)魏思?xì)胞表面可能也存在AOPP的結(jié)合蛋白，由此結(jié)合蛋白介導(dǎo)AOPP的生物學(xué)作用。 為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本課題首先在體外制備分離高純度、有活性的AOPP-人血清白蛋白(Humanser

5、umalbumin，HSA)，隨后建立以AOPP-HSA為靶點(diǎn)的生物傳感器技術(shù)平臺(tái)，在此技術(shù)平臺(tái)上，通過(guò)配體垂釣的方式，由單核細(xì)胞膜中定向分離AOPP結(jié)合蛋白，初步探討AOPP的作用途徑和機(jī)理，為尋找可能的干預(yù)靶點(diǎn)，阻斷AOPP的毒性作用，探索臨床防治CRF并發(fā)癥的新途徑奠定基礎(chǔ)。 本研究主要結(jié)果如下： 1.由HSA—HOCl孵育法體外制備了AOPP-HSA粗純品，經(jīng)SephadexG-100凝膠層析和Mono—Q陰離子

6、交換—高效液相色譜(HighperformanceliquidChromatography，HPLC)分離純化出AOPP-HSA，純度高達(dá)99.4％，經(jīng)紫外吸收光譜和熒光光譜、非變性和變性凝膠電泳鑒定，是含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)聚合物，分子量約700kD，為高分子量AOPP，在變性劑和還原劑存在條件下，能夠被完全解離為低分子量AOPP。單核細(xì)胞TNF-α分泌實(shí)驗(yàn)顯示，AOPP-HSA能夠顯著刺激單核細(xì)胞分泌TNF-α，具有促發(fā)單核細(xì)胞炎癥

7、反應(yīng)的活性。 2.將AOPP-HSA包被于生物傳感器的生物素樣品池，不能與單核細(xì)胞發(fā)生有效的結(jié)合反應(yīng)，而將其包被于羧甲基葡聚糖(Carboxymethyldextran，CMD)樣品池，能夠與單核細(xì)胞發(fā)生有效的結(jié)合，由此確定了最適反應(yīng)條件，從而建立了以AOPP-HSA為靶點(diǎn)，應(yīng)用CMD樣品池，分離AOPP結(jié)合蛋白的生物傳感器技術(shù)平臺(tái)。 3.應(yīng)用該技術(shù)平臺(tái)和生物傳感器的回收功能，由單核細(xì)胞膜中成功分離出兩種AOPP結(jié)合蛋白

8、，分子量分別為37kD和55kD，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmass，MALDI-TOFMS)鑒定，在現(xiàn)有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中均未檢索到可信的同源蛋白，提示可能是兩種新的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步的二級(jí)質(zhì)譜鑒定仍在進(jìn)行中。 本研究主要結(jié)論如下： 1.成功建立了以AOPP-HSA為靶點(diǎn)，應(yīng)用CMD樣品池，分離AOPP結(jié)合蛋白的生物

9、傳感器技術(shù)平臺(tái)，并首次實(shí)驗(yàn)證實(shí)AOPP-HSA與單核細(xì)胞之間存在結(jié)合。該技術(shù)平臺(tái)是完全可行的，具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、高效精確、回收方便等顯著優(yōu)點(diǎn)，不僅能夠用于AOPP與其結(jié)合蛋白相互作用的研究，還為其它尿毒癥毒素作用機(jī)理的研究提供了值得借鑒的方法。 2.應(yīng)用CMD樣品池生物傳感器技術(shù)平臺(tái)和其回收功能，首次由人單核細(xì)胞膜中分離出兩種AOPP結(jié)合蛋白，經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜鑒定，在現(xiàn)有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中均未檢索到可信的同源蛋白，提示可能是兩種新