晚期氧化蛋白產物誘導人腎小球內皮細胞發(fā)生間充質轉分化的機制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是全球范圍內引起終末期腎病的首要原因。蛋白尿是DN的主要臨床特征，也是促進DN進展的獨立危險因素，可由腎小球濾過屏障損害所致。腎小球內皮細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，在調節(jié)腎小球濾過率中發(fā)揮著重要的作用。腎小球內皮細胞損傷可導致腎小球濾過功能的功能失調，進而導致蛋白尿的發(fā)生。此外，近年來，越來越多研究提示腎小球內皮細胞功能失調可促DN的進展。值得注意的是，內皮細胞間充質轉

2、分化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT/EndoMT)，本質上可視為上皮細胞間充質轉分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的一種特殊類型，在內皮細胞損傷過程及腎小球硬化和腎小管間質纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而腎臟纖維化是DN的主要病理特征。EndMT發(fā)生時，內皮細胞失去其特異性標志物，如血小板內皮細胞粘附分子-1/CD31(plat

3、eletendothelial cell adhesion molecule/cluster of differentiation31,PECAM-1/CD31)、血管內皮細胞鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)、claudin5等，而重新獲得間充質細胞特異性標志物，如成纖維細胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）、波形蛋白(v

4、imentin)、和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等。EndMT這個概念最先出現(xiàn)在胚胎心臟發(fā)育中，但近年來越來越多的研究顯示EndMT在多種腎臟疾病中的腎纖維化過程中起著重要的作用。Zeisberg等學者利用三種不同的小鼠腎病模型（包括鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病模型），最先報道腎臟纖維化中肌成纖維細胞細胞可能來源于EndMT，而肌成纖維細胞在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。隨后，Li等學者研究證明

5、了EndMT可促進早期DN的腎臟纖維化的發(fā)生及發(fā)展過程。綜上，EndMT可促進DN腎臟纖維化的進展。因此，探討誘導EndMT發(fā)生的機制可能為DN的防治提供新的干預靶點。然而，目前關于EndMT發(fā)生的機制仍知之甚少。
　　多種因素可導致內皮細胞損傷。最近研究提示，晚期氧化蛋白產物(advancedoxidation protein products，AOPPs)可通過激活晚期糖基化終產物受體(receptorof advanced

6、glycation end products，RAGE)介導的信號通路激活血管內皮細胞。AOPPs是由Witko-Sarsat等學者于1996年首次在慢性腎衰患者血漿中發(fā)現(xiàn)的一類尿毒癥毒素，其主要成分是血清白蛋白酪氨酸殘基氧化后形成的蛋白交聯(lián)產物。近年來，越來越多的研究證據(jù)表明AOPPs參與了多種腎臟疾病(包括DN)的發(fā)生發(fā)展的過程。我們課題組最近的研究也證明了AOPPs可誘導人近端腎小管上皮細胞肥大及發(fā)生EMT。但是，AOPPs是否可

7、誘導EndMT的發(fā)生及其機制目前尚待闡明。
　　內質網(wǎng)應激反應(endoplasmic reticulum stress，ERS)在腎臟病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。內質網(wǎng)應激是由多種因素（如:饑餓、缺氧、病毒感染等）引起的病理生理狀態(tài)。內質網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊的蛋白可導致內質網(wǎng)應激，進而引起未折疊蛋白反應（一種內質網(wǎng)的適應性過程）。然而，由過強或持久的內質網(wǎng)應激引起的未折疊蛋白反應也可誘發(fā)細胞凋亡途徑。內質網(wǎng)應激可誘導肺上皮細

8、胞、甲狀腺上皮細胞、及腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。值得注意的是，研究表明內質網(wǎng)應激可導致腎小球內皮細胞損傷。但是，內質網(wǎng)應激在AOPPs誘導的腎小球內皮細胞損傷過程中的作用尚未明確。
　　目的：本研究以體外培養(yǎng)的人腎小球內皮細胞(human renal glomerular endothelialcells，HRGECs)為研究對象，首先，探討AOPPs是否可誘導人腎小球內皮細胞EndMT的發(fā)生，然后，探討AOPPs是否可誘導人腎小

9、球內皮細胞內質網(wǎng)應激的發(fā)生，最后，探討內質網(wǎng)應激是否介導了AOPPs誘導人腎小球內皮細胞EndMT的過程。
　　方法：
　　1.無內毒素AOPPs修飾蛋白的制備和鑒定
　　參考文獻方法體外制備AOPPs-BSA。將經(jīng)純化后、無內毒素的100 mg/mLBSA與200 mmol/L次氧酸等體積混合后（不含碳水化合物、游離脂肪酸和脂質，以排除形成AGEs樣結構），于室溫放置30分鐘后，即可制備出BSA與次氯酸摩爾比為1:1

10、40的AOPPs-BSA。制各的AOPPs-BSA在無菌PBS中透析24小時以去除游離的次氯酸。將100 mg/mL BSA與PBS等體積混合，作為對照。制備的AOPPs和BSA對照均需要經(jīng)過Detoxi-Gel凝膠柱去除內毒素。所有制備的AOPPs-BSA和未經(jīng)過修飾的BSA經(jīng)鱟試驗法檢測內毒素含量均低于0.025EU/ml。AOPPs含量通過測定酸性條件下340nm的光吸收，以氯胺T為標準取得。通過上述方法所制備的AOPPs-BSA

11、和未經(jīng)修飾的BSA的AOPPs含量分別為65.2±2.12 nmol/mg蛋白和0.2±0.04 nmol/mg蛋白。
　　2.人腎小球內皮細胞的培養(yǎng)
　　人腎小球內皮細胞HRGECs細胞購自美國ScienCell Research Laboratories。細胞復蘇后在37℃、5％CO2條件下，用含5％的胎牛血清、1％的內皮細胞生長添加劑(ECGS)及100 U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的內皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。待

12、細胞生長至約80％融合時用于進行試驗。本研究用2-5代細胞進行實驗。人腎小球內皮細胞在無血清培養(yǎng)基靜置細胞24小時后用于實驗。
　　3.AOPPs誘導人腎小球內皮細胞發(fā)生EndMT
　　人腎小球內皮細胞分別與AOPPs(50、100、200、及400μg/mL)或未經(jīng)修飾的BSA（200μg/mL）共同孵育24小時，或人腎小球內皮細胞分別與200μg/mLAOPPs或200μg/mL未經(jīng)修飾的BSA共同孵育12、24、48小

13、時，實時熒光定量PCR法檢測內皮細胞標志性物CD31、VE-cadherin、claudin5和間充質細胞標志性物FSP-1、α-SMA、及vimentin的mRNA表達水平
　　4.AOPPs激活人腎小球內皮細胞內質網(wǎng)應激
　　人腎小球內皮細胞分別與AOPPs(50、100、200、及400μg/mL)或未經(jīng)修飾的BSA(200μg/mL)共同孵育24小時，或人腎小球內皮細胞分別與200μg/mLAOPPs或200μg/m

14、L未經(jīng)修飾的BSA共同孵育12、24、48小時，實時熒光定量PCR法檢測內質網(wǎng)應激標志性蛋白GRP78和CHOP的mRNA表達水平
　　結果：。
　　1.AOPPs誘導人腎小球內皮細胞發(fā)生EndMT
　　為了探討AOPPs是否可誘導人腎小球內皮細胞發(fā)生EndMT，我們將人腎小球內皮細胞與AOPPs或未被修飾的BSA共同孵育后檢測內皮細胞標志性蛋白CD31、VE-cadherin、claudin5的表達變化及檢測間充質細

15、胞特異性標志性蛋白FSP-1、α-SMA、及vimentin的表達變化。實驗結果顯示，與空白對照組相比，AOPPs以濃度和時間依賴方式下調內皮細胞標志性蛋白（CD31、VE-cadherin、及claudin5）的mRNA表達水平，但以濃度和時間方式上調間充質細胞標志性蛋白(FSP-1、α-SMA、及vimentin)的mRNA表達水平。然而，未經(jīng)修飾的BSA對人腎小球內皮細胞的內皮標志性蛋白及間充質細胞標志性蛋白的表達水平無明顯影響，

16、提示這些變化與BSA的氧化修飾有關。以上實驗結果提示AOPPs可誘導人腎小球內皮細胞EndMT的發(fā)生。
　　2.AOPPs激活人腎小球內皮細胞的內質網(wǎng)應激反應
　　為了探討AOPPs是否會誘導人腎小球內皮細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激，我們使用實時熒光定量PCR法檢測內質網(wǎng)應激發(fā)生的標志性蛋白GRP78和CHOP的表達。實驗結果顯示，與空白對照組相比，AOPPs組以濃度和時間依賴方式上調GRP78和CHOP的mRNA表達水平。但是未經(jīng)修

17、飾的BSA對人腎小球內皮細胞GRP78和CHOP的表達水平無明顯影響，提示這些變化與BSA的氧化修飾有關。以上實驗結果提示AOPPs可誘導人腎小球內皮細胞內質網(wǎng)應激的發(fā)生。
　　綜合上述結果，內質網(wǎng)應激介導了AOPPs誘導人腎小球內皮細胞發(fā)生EndMT的過程。
　　結論：
　　本研究證明了AOPPs可誘導人腎小球內皮細胞發(fā)生EndMT，還證明了AOPPs可激活人腎小球內皮細胞內質網(wǎng)應激。然而，未修飾的BSA并不能產生A