牛蒡子苷對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、研究背景：
　　 腎臟纖維化是各種慢性腎臟病(chronickidneydiseases，CKD)的最終歸宿和必然結(jié)局，無(wú)論是各種原發(fā)性腎小球疾病、糖尿病、輸尿管阻塞，還是腎功能的損害都與腎臟纖維化程度密切相關(guān)，纖維化病變迄今無(wú)法阻抑或逆轉(zhuǎn)，因此加強(qiáng)CKD的早期防治，降低終末期腎病(end-stagerenaldisease，ESRD)的發(fā)病率具有十分重要的意義。
　　 足細(xì)胞是覆蓋于腎小球基底膜(glomerularb

2、asementmembrane，GBM)外壁的一種終末分化的細(xì)胞，其損傷后導(dǎo)致的濾過(guò)膜電荷和孔徑屏障的破壞，是蛋白尿形成的主要原因之一。足突之間裂孔膜蛋白的完整性是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵，這些蛋白的損傷或表達(dá)下降都可引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能障礙，從而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。尿蛋白不僅是腎小球損傷的結(jié)果，更是導(dǎo)致腎損傷進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。大量尿蛋白在腎小管管腔內(nèi)聚集可使小管上皮細(xì)胞受損，并促進(jìn)炎性物質(zhì)釋放，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在腎間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)，加劇腎間質(zhì)纖維化

3、，引起腎功能進(jìn)行性減退，最終可能發(fā)展為終末期腎衰竭。Nephrin、Podocin、CD2AP等構(gòu)成了足細(xì)胞裂孔膜蛋白復(fù)合體，其中Nephrin是接受及傳遞損傷信號(hào)的首要分子，其基因和蛋白表達(dá)異常在蛋白尿的發(fā)生機(jī)制中起著重要作用，Podocin在維持裂孔膜蛋白復(fù)合體的正常結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用。
　　 上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)現(xiàn)象是發(fā)生于腎臟纖維化早

4、期且可逆的過(guò)程，對(duì)此過(guò)程的研究引起眾多學(xué)者的關(guān)注。除腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生EMT、血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndoMT(endothelial-to-mesenchymaltransition，EndoMT)外，最新研究表明在TGF-β1作用下腎小球足細(xì)胞也可發(fā)生EMT，使足細(xì)胞表型改變，喪失足細(xì)胞特異性標(biāo)志、顯現(xiàn)轉(zhuǎn)分化特征，并表達(dá)肌成纖維特有的標(biāo)志性蛋白α-SMA，引起足細(xì)胞及腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能障礙，產(chǎn)生蛋白尿，同時(shí)EMT使足細(xì)胞獲得基質(zhì)分泌功

5、能，細(xì)胞外基質(zhì)分泌過(guò)多、降解減少，導(dǎo)致腎小球硬化，最終發(fā)展至纖維化。并且臨床研究顯示糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)等一些以蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的腎小球病變都伴有明顯的足細(xì)胞形態(tài)和功能異常。EMT在腎小球?yàn)V過(guò)屏障損傷、蛋白尿及腎小球硬化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，這為探索足細(xì)胞疾病的防治開(kāi)辟了嶄新的前景。
　　 晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)作為一類(lèi)促炎癥、促氧化的大分子生物毒素，存在于慢性腎功能衰竭(CRF)患者血漿中，是導(dǎo)致

6、CRF患者免疫功能紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、透析相關(guān)性淀粉樣變等長(zhǎng)期并發(fā)癥的重要致病環(huán)節(jié)。研究表明，AOPP不僅是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，同時(shí)也是氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的執(zhí)行者，在糖尿病及糖尿病高危人群如CKD、肥胖者體內(nèi)也增高，提示AOPP可能參與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展。陳詠梅等人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AOPP可引起腎小管上皮細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)增加。最近YANGLI等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AOPP可誘導(dǎo)足細(xì)胞特征性的蛋白nephrin、podocy表達(dá)

7、減少，并進(jìn)一步在體內(nèi)得到證實(shí)，且這與足細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和儲(chǔ)存Ca2+的主要場(chǎng)所，當(dāng)細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的需求超過(guò)其自身能力時(shí)出現(xiàn)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，或未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及ca2+平衡紊亂的狀態(tài)，稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，ERS是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，適度的ERS可以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、保持細(xì)胞活性，但是過(guò)強(qiáng)或過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的ERS可以誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子的大量釋放并且最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究證明ERS在動(dòng)

8、脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、腫瘤、病毒感染、老化等多種疾病進(jìn)展中起重要作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，ERS參與了一些原發(fā)性腎小球疾病、繼發(fā)性腎小球疾病如糖尿病腎病、藥物/毒物相關(guān)性腎小管-間質(zhì)損傷、腎缺血-再灌注損傷、慢性腎臟病等的發(fā)病機(jī)制。Markan等發(fā)現(xiàn)在膜性增生性腎小球腎炎以及急進(jìn)性腎小球腎炎中Grp78及CHOP蛋白表達(dá)水平顯著增高，而抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)水平卻顯著降低，提示在腎小球病變進(jìn)展過(guò)程中，多種有害物刺激誘導(dǎo)了

9、過(guò)度ERS，并且又可通過(guò)激活凋亡信號(hào)途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小球的進(jìn)行性損傷。無(wú)論是體外、體內(nèi)還是活檢病理均提示，足細(xì)胞ERS與足細(xì)胞損傷相關(guān)，并且最近研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺上皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞ERS可直接導(dǎo)致EMT，因此我們推測(cè)AOPP可能通過(guò)ERS或氧化應(yīng)激途徑引起EMT。
　　 中藥在延緩CRF進(jìn)展方面歷史悠久，有改善腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的作用，其中傳統(tǒng)中藥牛蒡子及其提取物牛蒡子苷(Arctiin)能有效減少尿蛋白、保護(hù)腎

10、臟，在防治慢性腎臟病中的作用逐漸引起廣泛關(guān)注，但其機(jī)制尚不清楚。牛蒡子為菊科植物牛蒡的干燥成熟果實(shí)，其味辛苦、性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、宣肺祛痰、利咽透疹、解毒消腫等功效。牛蒡子苷是從牛蒡子中提取分離而來(lái)的木脂素類(lèi)化合物，牛蒡子苷在消化道腸菌及肝臟中的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的作用下形成牛蒡子苷元而發(fā)揮作用。研究表明，牛蒡子可通過(guò)減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、腎皮質(zhì)單核趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子(

11、TNF-α)表達(dá)，降低腎皮質(zhì)蛋白激酶C(PKC)活性，影響腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解，減輕細(xì)胞內(nèi)蛋白非酶糖基化，增加足細(xì)胞固有蛋白nephrin、podocin的表達(dá)來(lái)發(fā)揮降尿蛋白、保護(hù)腎臟的作用。另外牛蒡子在原發(fā)性腎臟病方面的防治作用亦得到認(rèn)可，有研究發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白誘導(dǎo)的膜性腎小球腎炎模型大鼠，口服牛蒡子苷三周后，血肌酐、血尿素氮、尿蛋白含量顯著降低，內(nèi)生肌酐清除率顯著升高，纖維蛋白樣壞死、局灶性節(jié)段性增生等腎臟損害參數(shù)發(fā)

12、生逆轉(zhuǎn)。牛蒡子苷可降低糖尿病大鼠尿蛋白、減輕腎臟肥大、防止糖尿病腎小球硬化、改善糖尿病大鼠腎損害，通過(guò)減輕大鼠腎臟的高濾過(guò)、高灌注，從而保護(hù)腎功能。另外，牛蒡子苷通過(guò)抑制TNF-α、NO的大量釋放，從而對(duì)于慢性腎炎、腎病綜合征及慢性腎衰均有一定的防治作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Westernblotting技術(shù)觀察牛蒡子苷對(duì)AOPP刺激的小鼠足細(xì)胞ERS標(biāo)志性蛋白Grp78、CHOP以及平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)等表達(dá)的影響，探討

13、牛蒡子苷是否可通過(guò)減輕ERS從而逆轉(zhuǎn)EMT，從而為慢性腎臟病的早期防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 觀察牛蒡子苷對(duì)AOPP誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達(dá)的影響，探討牛蒡子苷是否可通過(guò)減輕ERS從而逆轉(zhuǎn)小鼠足細(xì)胞EMT，為中藥抗腎臟纖維化提供新的研究方向。
　　 研究方法：
　　 1.AOPP的制備:按文獻(xiàn)報(bào)道的方法將人血清白蛋白(HSA)與次氯酸溶液以1/140的摩爾

14、比例混合，室溫反應(yīng)30min(25～30℃)，用PBS透析24小時(shí)去除殘留次氯酸，制備的AOPP-HSA加入β-巰基乙醇終止反應(yīng)，離心超濾30min，加入適量PBS沖洗，再次離心超濾，通過(guò)測(cè)其OD值(340nm)來(lái)測(cè)量AOPP含量。
　　 2.通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)可觀察到AOPP刺激小鼠足細(xì)胞表達(dá)α-SMA蛋白最大效應(yīng)劑量點(diǎn)為200μg/ml，最佳效應(yīng)時(shí)間點(diǎn)為24小時(shí)。
　　 3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康墓卜譃?組:（1）.MPC5空白對(duì)照組

15、;（2）.MPC5＋BSA組;（3）.MPC5＋AOPP組;（4）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(50μmol/L)組;（5）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(100μmol/L)組;（6）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(200μmol/L)組;（7）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(400μmol/L)組;（8）.MPC5＋thapsigargin(0.25μmol/L)組;（9）.MPC5＋thapsigargi

16、n(0.25μmol/L)＋Arctiin(400μmol/L)組。
　　 4.各組分別培養(yǎng)24h后采用Westernblotting檢測(cè)ERS標(biāo)志性蛋白Grp78、CHOP以及α-SMA表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.Westernblotting測(cè)定Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表達(dá)水平
　　 觀察1-3組Westernblotting顯示，與空白組及白蛋白組對(duì)比，AOPP刺激MPC5

17、細(xì)胞24h后可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達(dá)均增高(P＜0.05)，提示AOPP可引起ERS和EMT。文獻(xiàn)報(bào)道Thapsigargin作為ERS誘導(dǎo)劑，可特異性的作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而對(duì)其他細(xì)胞器無(wú)影響，本實(shí)驗(yàn)觀察到毒胡蘿卜素同樣可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達(dá)增高。
　　 2.Westernblotting測(cè)定Arctiin干預(yù)后Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表達(dá)水平
　　 200μg/m

18、l的AOPP刺激MPC5細(xì)胞24h后可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達(dá)增高，而加入Arctiin可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。隨著Arctiin濃度的增高，Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達(dá)呈持續(xù)下降趨勢(shì)，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)性。當(dāng)Arctiin濃度達(dá)400μmol/L時(shí)，Grp78、CHOP、α-SMA表達(dá)水平與MPC5＋AOPP組以及50μmol/L牛蒡子苷組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，牛蒡子苷可

19、逆轉(zhuǎn)毒胡蘿卜素引起的ERS及α-SMA蛋白表達(dá)增高。
　　 研究結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)成功觀察到AOPP條件下培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯升高，用牛蒡子苷作用后，三種蛋白表達(dá)水平持續(xù)降低，且呈劑量依賴(lài)性，證實(shí)了AOPP可能通過(guò)引起小鼠足細(xì)胞ERS從而導(dǎo)致EMT，同時(shí)也證實(shí)了牛蒡子苷可以下調(diào)AOPP及毒胡蘿卜素刺激后引起的Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明牛蒡子苷則可通過(guò)