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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致患者死亡、殘疾的主要原因之一。
越來(lái)越多的研究證實(shí),足細(xì)胞的損傷和凋亡在糖尿病腎病的早期發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。
目前,AOPPs(advancedoxidative protein products,晚期氧化蛋白產(chǎn)物)在糖尿病腎病中的致病作用逐漸引起了廣泛的關(guān)注。GLP-1(glucagon-lik
2、e peptide-1,胰高血糖素樣肽-1)在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等可拮抗AGEs或AOPPs的致炎癥、致氧化應(yīng)激作用。
探討減少足細(xì)胞的早期損傷和凋亡作用因素和機(jī)制,將為臨床糖尿病腎病的早期干預(yù)提供新的思路和策略。本研究以AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡為研究模型,探討GLP-1干預(yù)對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制,以期為拓展GLP-1的腎臟保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的:
本課題擬在以AO
3、PPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡為研究模型的基礎(chǔ)上,通過(guò)觀察GLP-1干預(yù)對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響,同時(shí)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及對(duì)AOPPs-RAGE通路的影響,初步探討GLP-1對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制。
內(nèi)容:
課題分為以下兩大部分:
第一部分 GLP-1對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響
目的:
以AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡為研究模型,觀測(cè)GLP-1干預(yù)對(duì)AOPPs誘導(dǎo)
4、足細(xì)胞凋亡的影響。
方法:
1.體外制備、鑒定AOPP
將20 mg/ml小鼠血清白蛋白(RSA)與等體積的40 mmol/l次氯酸混合,放置30min,制備出RSA與次氯酸摩爾比為1∶140的AOPP。制備的AOPP經(jīng)由無(wú)內(nèi)毒素PBS透析24h,除去過(guò)多游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后4℃保存。20 mg/ml RSA與PBS等體積混合,作為對(duì)照。以熒光分光光度計(jì)鑒定AOPP。
5、2.培養(yǎng)足細(xì)胞
增殖期:33℃孵箱培養(yǎng)。在重組小鼠γ-干擾素誘導(dǎo)下增生,待其長(zhǎng)至約85%,使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞后傳代。分化期:待細(xì)胞長(zhǎng)至30-40%時(shí),用不含IFN-γ的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng),每周換液2-3次,約培養(yǎng)10-14天。目標(biāo):長(zhǎng)出足突,最好長(zhǎng)出二級(jí)足突。
3.CCK8法測(cè)定細(xì)胞的活力
實(shí)驗(yàn)分組:200μg/mLAOPPs與不同濃度GLP-1(0、10、50、100、20
6、0 nmol/L)共同作用足細(xì)胞48h。
將上述各組細(xì)胞按每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度種于96孔板的玻片上,待達(dá)到70%-90%融合時(shí)收集細(xì)胞。每孔加入10μl CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD450nm處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置空白孔和對(duì)照孔。細(xì)胞存活率=(測(cè)定組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。
4.Hoechst33258熒光染色觀察各組足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
5.流
7、式細(xì)胞儀檢測(cè)分析足細(xì)胞凋亡率
實(shí)驗(yàn)共分為4組,依次為陰性對(duì)照RSA組、200μg/mLAOPPs、100nmol/LGLP-1組、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組,作用足細(xì)胞48h后,收集各組細(xì)胞,離心,棄上清,PBS液清洗二次,均勻吹散沉淀細(xì)胞,加入AnnexinⅤ和碘化丙啶(Pl),避光放置15min,于流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè),軟件分析細(xì)胞凋亡率。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS20.
8、0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬計(jì)量資料,則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用單向方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn),兩兩比較采用LSD法。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.050,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.研究不同濃度GLP-1(0、10、50、100、200 nmol/L)拮抗200μg/mLAOPPs對(duì)足細(xì)胞的活性影響
AOPPs組的OD值為0.10±0.02,與陰性對(duì)照組(0
9、.35±0.02)相比,有顯著差異(P=0.000)。
2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
藥物干預(yù)各組足細(xì)胞48h后,Hoechst33258染色,于熒光顯微鏡下觀察:可見(jiàn)陰性對(duì)照組足細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)呈均勻熒光;AOPPs組的細(xì)胞核固縮,核致密濃染或裂解呈碎塊狀,核染色質(zhì)邊集;AOPPs+GLP-1細(xì)胞核濃染、固縮及核碎裂的細(xì)胞較AOPPs組明顯減少。
3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率
各組細(xì)胞經(jīng)藥物作用48h
10、后,AOPPs組的足細(xì)胞總凋亡率為(26.78±2.58)%。
結(jié)論:
GLP-1在一定的濃度范圍(50~200 nmol/L)內(nèi)有拮抗AOPPs抑制足細(xì)胞活性的作用,而且可部分減少AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
第二部分 GLP-1抑制AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的機(jī)制
第一節(jié) GLP-1對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞的氧化應(yīng)激caspase家族主要酶的影響
目的:
通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)足細(xì)
11、胞氧化應(yīng)激水平,并采用酶聯(lián)反應(yīng)法檢測(cè)caspase-9、-3酶活性,探討GLP-1在足細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用的可能機(jī)制。
方法:
1.激光共聚焦檢測(cè)活性氧(ROS)
在處理好的足細(xì)胞中加入DCFH2DA熒光探針(用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶1000稀釋?zhuān)?duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行熒光標(biāo)記,在37℃含5%C02的培養(yǎng)箱中孵育30min,棄去培養(yǎng)液,PBS液清洗3次,在熒光顯微鏡下觀察各組中細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。
2.ELIS
12、A法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3酶活性
各組細(xì)胞孵育48h,消化、離心后、用細(xì)胞裂解液重懸,再加入對(duì)應(yīng)的反應(yīng)底物。37℃水浴2h后,加樣至96孔培養(yǎng)板,最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)OD值,檢測(cè)波長(zhǎng)為405 nm。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(i±s)表示,采用單向方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn),兩兩比較采用LSD法。P<0.050,具
13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
AOPPs作用于足細(xì)胞48h后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性增加,GLP-1可部分減少AOPPs誘導(dǎo)的這些效應(yīng)。
第二節(jié) Exendin9-39對(duì)AOPPs誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)通路的影響
目的:
研究GLP-1受體抑制劑Exendin9-39對(duì)AOPPs-RAGE信號(hào)通路及其下游Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討GLP-1
14、減輕AOPPs所致足細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
方法:
1.實(shí)驗(yàn)共分為4組,分別為陰性對(duì)照組、200μg/mLAOPPs、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組+ GLP-1受體抑制劑(exentin9-39),作用足細(xì)胞48h。
2.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(余同第一章)
3.qPCR測(cè)RA
15、GE mRNA
細(xì)胞使用胰酶進(jìn)行消化,以1×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi),培養(yǎng)24h,吸去培養(yǎng)基,干預(yù)結(jié)束后,Trizol提取總RNA,并采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA含量的檢測(cè),根據(jù)RT-PCR試劑盒進(jìn)行操作,使用熒光定量PCR法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。
4.Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞RAGE、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)
收集各組細(xì)胞,根據(jù)蛋白提取試劑盒操作,分別提取各組細(xì)胞總蛋白及核蛋
16、白,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組蛋白質(zhì)樣本20μg,以12%SDS-PAOPP進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2h,洗膜后加入RSA-TBS稀釋的抗RAGE抗體、抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1000),抗Bax(1∶2000)單克隆抗體,4℃孵育過(guò)夜,再次洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)雜交1h,洗膜后顯色,結(jié)果用Image J分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS20.0進(jìn)
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