胰高血糖素樣肽-1對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者死亡、殘疾的主要原因之一。
　　越來(lái)越多的研究證實(shí)，足細(xì)胞的損傷和凋亡在糖尿病腎病的早期發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。
　　目前，AOPPs(advancedoxidative protein products，晚期氧化蛋白產(chǎn)物)在糖尿病腎病中的致病作用逐漸引起了廣泛的關(guān)注。GLP-1（glucagon-lik

2、e peptide-1，胰高血糖素樣肽-1）在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等可拮抗AGEs或AOPPs的致炎癥、致氧化應(yīng)激作用。
　　探討減少足細(xì)胞的早期損傷和凋亡作用因素和機(jī)制，將為臨床糖尿病腎病的早期干預(yù)提供新的思路和策略。本研究以AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡為研究模型，探討GLP-1干預(yù)對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，以期為拓展GLP-1的腎臟保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的:
　　本課題擬在以AO

3、PPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡為研究模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察GLP-1干預(yù)對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及對(duì)AOPPs-RAGE通路的影響，初步探討GLP-1對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制。
　　內(nèi)容:
　　課題分為以下兩大部分:
　　第一部分 GLP-1對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:
　　以AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡為研究模型，觀測(cè)GLP-1干預(yù)對(duì)AOPPs誘導(dǎo)

4、足細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:
　　1.體外制備、鑒定AOPP
　　將20 mg/ml小鼠血清白蛋白(RSA)與等體積的40 mmol/l次氯酸混合，放置30min，制備出RSA與次氯酸摩爾比為1∶140的AOPP。制備的AOPP經(jīng)由無(wú)內(nèi)毒素PBS透析24h，除去過(guò)多游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后4℃保存。20 mg/ml RSA與PBS等體積混合，作為對(duì)照。以熒光分光光度計(jì)鑒定AOPP。
　　

5、2.培養(yǎng)足細(xì)胞
　　增殖期:33℃孵箱培養(yǎng)。在重組小鼠γ-干擾素誘導(dǎo)下增生，待其長(zhǎng)至約85％，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞后傳代。分化期:待細(xì)胞長(zhǎng)至30-40％時(shí)，用不含IFN-γ的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2-3次，約培養(yǎng)10-14天。目標(biāo):長(zhǎng)出足突，最好長(zhǎng)出二級(jí)足突。
　　3.CCK8法測(cè)定細(xì)胞的活力
　　實(shí)驗(yàn)分組:200μg/mLAOPPs與不同濃度GLP-1(0、10、50、100、20

6、0 nmol/L)共同作用足細(xì)胞48h。
　　將上述各組細(xì)胞按每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度種于96孔板的玻片上，待達(dá)到70％-90％融合時(shí)收集細(xì)胞。每孔加入10μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD450nm處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置空白孔和對(duì)照孔。細(xì)胞存活率=（測(cè)定組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）。
　　4.Hoechst33258熒光染色觀察各組足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　5.流

7、式細(xì)胞儀檢測(cè)分析足細(xì)胞凋亡率
　　實(shí)驗(yàn)共分為4組，依次為陰性對(duì)照RSA組、200μg/mLAOPPs、100nmol/LGLP-1組、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組，作用足細(xì)胞48h后，收集各組細(xì)胞，離心，棄上清，PBS液清洗二次，均勻吹散沉淀細(xì)胞，加入AnnexinⅤ和碘化丙啶(Pl)，避光放置15min，于流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，軟件分析細(xì)胞凋亡率。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS20.

8、0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬計(jì)量資料，則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用單向方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。P＜0.050，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.研究不同濃度GLP-1(0、10、50、100、200 nmol/L)拮抗200μg/mLAOPPs對(duì)足細(xì)胞的活性影響
　　AOPPs組的OD值為0.10±0.02，與陰性對(duì)照組(0

9、.35±0.02)相比，有顯著差異(P=0.000)。
　　2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　藥物干預(yù)各組足細(xì)胞48h后，Hoechst33258染色，于熒光顯微鏡下觀察:可見(jiàn)陰性對(duì)照組足細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)呈均勻熒光;AOPPs組的細(xì)胞核固縮，核致密濃染或裂解呈碎塊狀，核染色質(zhì)邊集;AOPPs+GLP-1細(xì)胞核濃染、固縮及核碎裂的細(xì)胞較AOPPs組明顯減少。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率
　　各組細(xì)胞經(jīng)藥物作用48h

10、后，AOPPs組的足細(xì)胞總凋亡率為（26.78±2.58）％。
　　結(jié)論:
　　GLP-1在一定的濃度范圍(50～200 nmol/L)內(nèi)有拮抗AOPPs抑制足細(xì)胞活性的作用，而且可部分減少AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 GLP-1抑制AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　　第一節(jié) GLP-1對(duì)AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞的氧化應(yīng)激caspase家族主要酶的影響
　　目的:
　　通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)足細(xì)

11、胞氧化應(yīng)激水平，并采用酶聯(lián)反應(yīng)法檢測(cè)caspase-9、-3酶活性，探討GLP-1在足細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.激光共聚焦檢測(cè)活性氧(ROS)
　　在處理好的足細(xì)胞中加入DCFH2DA熒光探針（用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶1000稀釋?zhuān)?duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行熒光標(biāo)記，在37℃含5％C02的培養(yǎng)箱中孵育30min，棄去培養(yǎng)液，PBS液清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察各組中細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。
　　2.ELIS

12、A法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3酶活性
　　各組細(xì)胞孵育48h，消化、離心后、用細(xì)胞裂解液重懸，再加入對(duì)應(yīng)的反應(yīng)底物。37℃水浴2h后，加樣至96孔培養(yǎng)板，最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為405 nm。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(i±s)表示，采用單向方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法。P＜0.050，具

13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　AOPPs作用于足細(xì)胞48h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性增加，GLP-1可部分減少AOPPs誘導(dǎo)的這些效應(yīng)。
　　第二節(jié) Exendin9-39對(duì)AOPPs誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)通路的影響
　　目的:
　　研究GLP-1受體抑制劑Exendin9-39對(duì)AOPPs-RAGE信號(hào)通路及其下游Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討GLP-1

14、減輕AOPPs所致足細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)共分為4組，分別為陰性對(duì)照組、200μg/mLAOPPs、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組、200μg/mLAOPPs+100 nmol/LGLP-1組+ GLP-1受體抑制劑(exentin9-39)，作用足細(xì)胞48h。
　　2.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡（余同第一章）
　　3.qPCR測(cè)RA

15、GE mRNA
　　細(xì)胞使用胰酶進(jìn)行消化，以1×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24h，吸去培養(yǎng)基，干預(yù)結(jié)束后，Trizol提取總RNA，并采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA含量的檢測(cè)，根據(jù)RT-PCR試劑盒進(jìn)行操作，使用熒光定量PCR法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。
　　4.Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞RAGE、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)
　　收集各組細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作，分別提取各組細(xì)胞總蛋白及核蛋

16、白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組蛋白質(zhì)樣本20μg，以12％SDS-PAOPP進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后5％脫脂奶粉封閉2h，洗膜后加入RSA-TBS稀釋的抗RAGE抗體、抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1000)，抗Bax(1∶2000)單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，再次洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)雜交1h，洗膜后顯色，結(jié)果用Image J分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS20.0進(jìn)