胰高血糖素樣肽-1對胰島β細(xì)胞增殖、凋亡、自噬的影響及機制探討.pdf

1、本文以大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞株作為研究對象,應(yīng)用長效胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物—利拉魯肽干預(yù)INS-1細(xì)胞株,觀察細(xì)胞的增殖、凋亡及自噬的改變,并探討其作用機制。
　　第一部分，GLP-1通過AMPK/mTOR通路促進胰島β細(xì)胞增殖
　　在正常糖(11.1mmol/L)和高糖(30mmol/L)環(huán)境下分別利用利拉魯肽干預(yù)INS-1細(xì)胞株,應(yīng)用CCK-8法分析細(xì)胞增殖的改變;Westernblot方法分析AMP

2、K/mTOR通路及下游P70S6K、4EBP1的蛋白表達(dá);在此基礎(chǔ)上加用mTOR通路抑制劑—AICAR(AMPK激活劑)或雷帕霉素(mTOR抑制劑)后,檢測細(xì)胞增殖活性的改變。結(jié)果:1、在正常糖和高糖環(huán)境下GLP-1均可促進INS-1細(xì)胞增殖;2、GLP-1可抑制AMPK表達(dá),促進mTOR蛋白及其下游靶點P70S6K和4EBP1蛋白表達(dá);3、應(yīng)用mTOR通路抑制劑后,mTOR及mTOR下游靶蛋白表達(dá)受抑制,且GLP-1對細(xì)胞的促增殖作用

3、明顯減弱。結(jié)論:GLP-1在正常糖及高糖環(huán)境中均可促進胰島β細(xì)胞增殖,AMPK/mTOR通路可能參與了這一過程。
　　第二部分，高糖環(huán)境下GLP-1通過抑制AMPK表達(dá)促進胰島β細(xì)胞自噬
　　在高糖(30mmol/L)環(huán)境下應(yīng)用利拉魯肽干預(yù)INS-1細(xì)胞株,觀察自噬相關(guān)指標(biāo),包括自噬相關(guān)蛋白(LC3、Atg7、p62)表達(dá)、MDC染色,LC3免疫熒光及透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體;應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染增強AMPK表達(dá)或AICAR特異性激

4、活A(yù)MPK后,觀察上述自噬相關(guān)指標(biāo)的改變,探討GLP-1調(diào)控胰島β細(xì)胞自噬的機制。結(jié)果:1、應(yīng)用GLP-1后,INS-1細(xì)胞內(nèi)LC3II/I比例升高,Atg7表達(dá)增強,p62表達(dá)減弱;MDC染色陽性細(xì)胞數(shù)增多;免疫熒光提示LC3表達(dá)增多;電鏡結(jié)果提示自噬體形成增加,表明GLP-1可增強胰島β細(xì)胞自噬功能。2、激活A(yù)MPK后,GLP-1促進INS-1細(xì)胞自噬的作用被減弱。結(jié)論:高糖環(huán)境下GLP-1可能通過抑制AMPK表達(dá)來促進胰島β細(xì)胞自

5、噬。
　　第三部分，高糖環(huán)境下GLP-1通過促進自噬抑制胰島β細(xì)胞凋亡
　　在高糖(30mmol/L)環(huán)境下應(yīng)用利拉魯肽干預(yù)INS-1細(xì)胞株,觀察凋亡相關(guān)指標(biāo),Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)及Hoechst33342染色;應(yīng)用自噬抑制劑(3-MA)抑制自噬后,觀察上述凋亡相關(guān)指標(biāo)改變。結(jié)果:1、GLP-1干預(yù)后Bcl-2表達(dá)增強,Bax表達(dá)減弱,Caspase-3表達(dá)減弱,Hoechst33342染色細(xì)胞凋亡

6、核減少;2、3-MA抑制自噬后,GLP-1抗INS-1細(xì)胞凋亡作用被減弱。結(jié)論:高糖環(huán)境下GLP-1可抑制胰島β細(xì)胞凋亡,自噬作用可能在其中起到了一定的作用。
　　綜上所述,GLP-1可通過AMPK/mTOR通路促進胰島β細(xì)胞增殖,通過抑制AMPK表達(dá)增強β細(xì)胞自噬。同時GLP-1具有抑制高糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡作用,自噬活動增強可能是其抑制細(xì)胞凋亡的因素之一。GLP-1可能通過以上機制減弱高糖對胰島β細(xì)胞的損傷,為2型糖尿病的臨床防