腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)生成內(nèi)皮細(xì)胞微粒的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 ①制作適合蛋白質(zhì)組學(xué)研究的離體活化血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)模型;
　　 ②研究經(jīng)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化與其生成的內(nèi)皮細(xì)胞微粒(endothelial microparticle

2、，EMP)蛋白質(zhì)組成的關(guān)聯(lián);
　　 ③探討EMP所轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)在其與靶細(xì)胞相互作用過程中發(fā)揮的作用。
　　 內(nèi)容：
　　 ①采用TNF-α激活HUVEC使其生成EMP，研究其量效和時(shí)效關(guān)系，制作離體的活化內(nèi)皮細(xì)胞模型，并對(duì)EMP表型進(jìn)行探討;
　　 ②運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析TNF-α刺激前后HUVEC蛋白質(zhì)表達(dá)差異;
　　 ③運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)TNF-α誘導(dǎo)生成的EMP蛋白質(zhì)組成，通過

3、與TNF-α刺激前后HUVEC差異蛋白的比較，尋找共同蛋白，分析這些蛋白質(zhì)的功能，探討內(nèi)皮細(xì)胞活化過程中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及EMP的功能。
　　 方法：
　　 ①體外培養(yǎng)原代HUVEC，予以不同反應(yīng)濃度和作用時(shí)間的TNF-α刺激，誘導(dǎo)其生成并釋放EMP，同時(shí)以靜息狀態(tài)HUVEC作為正常對(duì)照。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EMP數(shù)量及其表面CD62E、CD31表達(dá)情況，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 ②運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)中的2-DE和M

4、ALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)比較分析TNF-α刺激前后HUVEC蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，尋找差異蛋白。
　　 ③運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)中的LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)鑒定TNF-α誘導(dǎo)生成的EMP蛋白質(zhì)組成，將其與HUVEC差異蛋白進(jìn)行比較，尋找共同蛋白。
　　 ④運(yùn)用GO(gene ontology)和KEGG pathway對(duì)所發(fā)現(xiàn)的共同蛋白進(jìn)行分析，獲得其分布和功能等方面的信息。
　　 結(jié)果：
　　 ①100n

5、g/ml TNF-α刺激HUVEC24h生成的EMP數(shù)量最多。反應(yīng)濃度100ng/ml時(shí)TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMP數(shù)量與10ng/ml、200ng/ml的相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);作用時(shí)間24h時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMP數(shù)量與1h、3h的相比差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 ②反應(yīng)24h時(shí)，TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD31+EMP數(shù)量及CD62E和CD31雙陽性EMP數(shù)量與EMP總數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0

6、5），而CD62E+EMP數(shù)量與EMP總數(shù)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 ③2-DE技術(shù)顯示TNF-α刺激前后HUVEC共有47個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，使用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)成功鑒定其中29個(gè)差異蛋白，包括8個(gè)蛋白質(zhì)刺激后上調(diào)、12個(gè)刺激后下調(diào)、8個(gè)刺激后不再表達(dá)、1個(gè)刺激后新表達(dá)。
　　 ④LC-MS/MS技術(shù)顯示TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMP包含83個(gè)蛋白質(zhì)，與29個(gè)HUVEC差異蛋白比較后發(fā)現(xiàn)8

7、個(gè)共同蛋白。在經(jīng)TNF-α刺激HUVEC中，這8個(gè)蛋白質(zhì)中1個(gè)表現(xiàn)為不再表達(dá)，4個(gè)表現(xiàn)為刺激后下調(diào)，3個(gè)表現(xiàn)為刺激后上調(diào)。
　　 ⑤8個(gè)共同蛋白中包含了HUVEC上調(diào)的差異蛋白中表達(dá)量差異最大者h(yuǎn)eat shock protein beta-1，以及下調(diào)的差異蛋白中表達(dá)量差異最大者annexin A2。
　　 ⑥8個(gè)共同蛋白在炎癥反應(yīng)、凝血反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等方面具有重要作用。
　　 結(jié)論：
　　

8、①TNF-α刺激HUVEC生成EMP的數(shù)量與TNF-α的反應(yīng)濃度和作用時(shí)間有關(guān)，100ng/ml TNF-α刺激HUVEC24h可產(chǎn)生較多數(shù)量EMP，以此為依據(jù)可制作適合蛋白質(zhì)組學(xué)研究的離體活化VEC模型。
　　 ②CD62E+可用于TNF-α誘導(dǎo)生成EMP的表型鑒定。
　　 ③HUVEC經(jīng)TNF-α刺激后29個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生了表達(dá)量或表達(dá)種類的改變，而其生成的EMP蛋白質(zhì)組成與這些蛋白質(zhì)表達(dá)的改變有直接關(guān)聯(lián)。