可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素球部融合蛋白的真核表達研究.pdf

1、目的：
　　 構建一種人腫瘤壞死因子受體Ⅱ胞外區(qū)與人脂聯(lián)素球部的融合基因sTNFRⅡ-gAD,且相應的融合蛋白在哺乳動物BHK-21S細胞的無血清培養(yǎng)體系中實現(xiàn)表達,對該融合蛋白進行了初步鑒定,并且進一步對sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的大量制備進行初步探索。
　　 方法：
　　 用RT-PCR方法從人的外周血淋巴細胞總RNA中擴增人腫瘤壞死因子Ⅱ型受體胞外區(qū)基因片段,與脂聯(lián)素球部基因片段融合,克隆至pAAV2ne

2、o表達載體中,構建成pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD,同時構建對照質粒pAAV2neo-Gluc-gAD。隨后,用pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD轉染BHK-21S細胞獲得G418抗性細胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD；然后,將原來含有血清的培養(yǎng)液換成無血清的化學成分限定的培養(yǎng)液,細胞從貼壁培養(yǎng)方式轉換成懸浮培養(yǎng)方

3、式；最后,收獲BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD無血清懸浮培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)上清,進行sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的鑒定分析。此外,為便于后續(xù)大規(guī)模生產及對sTNFRⅡ-gAD蛋白的特性研究,采用有限稀釋法篩選BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD混合細胞株,獲得高表達sTNFRⅡ-gAD蛋白的單克隆細胞株,并對此細胞株進行大規(guī)模無血清轉瓶培養(yǎng),對培

4、養(yǎng)收獲的上清進行硫酸銨沉淀濃縮獲得sTNFRⅡ-gAD蛋白粗制品。
　　 結果：
　　 (1)構建獲得了pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD兩種質粒,酶切與測序顯示正確。
　　 (2)用抗人腫瘤壞死因子受體Ⅱ和抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體分別檢測pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD瞬時轉染的BHK-21S細胞,免疫熒光呈現(xiàn)陽性。
　　 用抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體檢測

5、pAAV2neo-Gluc-gAD瞬時轉染的BHK-21S細胞,免疫熒光呈現(xiàn)陽性,而用抗人腫瘤壞死因子受體Ⅱ檢測呈現(xiàn)陰性。
　　 (3)pAAV2neo-Gluc-gAD質粒瞬時轉染BHK-21S細胞24h后上清中的Gluc有較高表達。
　　 (4)免疫印跡分析用抗人腫瘤壞死因子受體Ⅱ和抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體檢測在pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD穩(wěn)定轉染的BHK-21S細胞上清中檢測到sTNFRⅡ-gAD融合蛋

6、白的表達,并以單體、三聚體和三聚體以上的多聚體形式存在。
　　 免疫印跡分析用抗人脂聯(lián)素球部的單克隆抗體檢測在pAAV2neo-Gluc-gAD穩(wěn)定轉染的BHK-21S細胞上清檢測到Gluc-gAD融合蛋白的表達。
　　 (5)上清中sTNFRⅡ-gAD融合蛋白具有顯著抑制TNFα殺傷L929細胞的活性,而對照Gluc-gAD蛋白不具備此活性。
　　 (6)有限稀釋法篩選獲得相對高表達sTNFRⅡ-gAD蛋白的B

7、HK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD細胞克隆株,命名為3號克隆。
　　 (7)探索獲得了一種快速檢測上清中sTNFRⅡ-gAD蛋白表達的方法:點雜交。
　　 (8)可采用硫酸銨方法對上清中sTNFRⅡ-gAD融合蛋白進行濃縮。
　　 結論：
　　 成功構建了pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD和對照質粒pAAV2neo-Gluc-gAD,兩種質粒分別轉染BHK-21S細胞后相應的蛋白在上