基質(zhì)金屬蛋白酶9對大腸癌細胞釋放可溶性腫瘤壞死因子受體1的作用.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)功能的發(fā)揮依賴其膜受體(TumornecrosisfactorreceptorTNFR)。體內(nèi)外實驗已證實mTNFR(Membrane-boundtumornecrosisfactorreceptormTNFR)介導(dǎo)TNF的程序化死亡作用(apoptosis)、病毒感染肝細胞的清除作用以及其對腫瘤細胞的殺傷作用，是機體殺滅清除腫瘤細胞重要的靶位點，在TNFR表達陰性的大

2、腸癌細胞株經(jīng)轉(zhuǎn)染TNFR基因后其細胞膜高度表達TNFR，而這種轉(zhuǎn)染細胞可被重組TNF殺傷。體內(nèi)有多種免疫活性因子(如干擾素、白介素等)即通過激活上調(diào)TNFR以達到清除腫瘤細胞的目的，這也是腫瘤免疫治療、生物治療的基礎(chǔ)，因而誘導(dǎo)并穩(wěn)定腫瘤細胞膜TNFR對機體抗腫瘤作用致關(guān)重要。可溶性腫瘤壞死因子受體(Solubletumornecrosisfactorreceptor，sTNFR)來源于相應(yīng)TNFR的膜外段，可結(jié)合TNF，并以此阻止TNF

3、與細胞膜表面的TNFR結(jié)合。因此，在體內(nèi)具有重要的免疫抑制作用。sTNFR已被作為免疫抑制劑應(yīng)用于臨床如器官移植后的急性排斥反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療。而對腫瘤治療，則需克服免疫抑制。已有研究證實大腸癌患者體液中存在著高水平的sTNFR，其濃度與患者病情、病程及其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)系。我們的研究顯示大腸癌患者血清高水平的sTNFR主要來源于腫瘤細胞膜TNFR的脫落釋放。一方面，腫瘤細胞失去了機體免疫系統(tǒng)作用的靶位點；另一方面，大

4、量的sTNFR釋放入血，對機體具有強烈的免疫抑制作用，從而加速了患者惡液質(zhì)狀態(tài)的形成，這是腫瘤細胞針對機體主動分泌可溶性受體分子以抵抗機體對腫瘤的殺傷作用，實現(xiàn)腫瘤細胞免疫逃逸的重要方式。目前腫瘤細胞釋放sTNFR的確切機理還不明了，可能和某種活性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的酶解有關(guān)，故而通過抑制酶活性以減少sTNFR的產(chǎn)生，可能成為腫瘤治療的新手段，而金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶主要的生理抑制劑，對活性MMPs具

5、有相對專一的抑制作用，在侵襲性腫瘤組織中MMPs的高表達程度總要高于TIMPs，正由于這種平衡被打破，導(dǎo)致了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。 本研究初步探討MMP-9對大腸癌細胞株釋放sTNFR1的促進作用及促進大腸癌轉(zhuǎn)移的可能機制。 方法：我們選擇大腸癌細胞株Lovo、SW620、SW480、SW1116，研究細胞膜表面TNFR1的表達，同時以SW1116細胞為靶細胞，觀察其經(jīng)MMP-9作用前后TNFR1表達量的變化及細胞培養(yǎng)上清中

6、sTNFR1的改變。 一、大腸癌細胞株爬片的制備及免疫熒光染色：將培養(yǎng)的大腸癌細胞株SW1116，SW620，SW480，LOVO細胞調(diào)成5×104/mL的細胞懸液，接種于24孔板中，每孔預(yù)先置入6mm×6mm蓋玻片一張，待細胞生長狀態(tài)良好時終止培養(yǎng)。4％多聚甲醛固定爬片后進行免疫熒光染色。 二、大腸癌細胞株細胞膜表面TNFR1的表達的觀察：將以上制備好的細胞爬片在熒光顯微鏡下觀察，TNFR1陽性表達細胞在熒光顯微鏡下發(fā)

7、出綠色熒光。選取SW1116細胞在激光共聚焦顯微鏡下觀察照像。 三、MMP-9對大腸癌細胞株表面TNFR1表達的影響：人SW1116大腸癌細胞以2×105/mL接種于24孔板，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h使細胞吸附在培養(yǎng)板上換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入含有活化后MMP-9的RPMI-1640培養(yǎng)基(無血清)進行干預(yù)，總體積為500μL。分組如下①MMP9Ong/mL；②MMP9154ng/mL；③MMP9385

8、ng/mL；④MMP9770ng/mL；⑤MMP91155ng/mL，干預(yù)3h;或用MMP9770ng/mL干預(yù)0、1.5、3、6和9h。將以上干預(yù)前、后的細胞進行流式細胞儀檢測細胞表面TNFR1的表達情況，并將細胞培養(yǎng)上清用EP管分裝，-20℃冰箱凍存，以備第二部實驗使用。 四、細胞培養(yǎng)上清中sTNFR1的表達：將第一部分MMP-9干預(yù)前后凍存的細胞培養(yǎng)上清室溫凍融，500×g離心5min后，用人sTNF-RI定量EIA試劑盒

9、檢測上清中sTNF-RI含量。 五、統(tǒng)計方法：實驗數(shù)據(jù)以X±S表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件中的one-wayANOVA和LSD及線性相關(guān)分析進行統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果 一、大腸癌各細胞株表面表達TNFR1：熒光顯微鏡下觀察顯示FITC標記的四株大腸癌細胞株表面均表達TNFR1；在激光共聚焦顯微鏡下可更清楚地觀察到，F(xiàn)ITC標記的SW1116大腸癌細胞株表面表達TNFR1。 二、當時間固定為3h，不同濃度M

10、MP-9對SW1116細胞TNFR1表達的影響：流式細胞檢測結(jié)果顯示TNFR1的表達，在不同的濃度MMP-9作用3h后，MMP-9Ong/mL組(表達率90.92％)；MMP-9154ng/mL組(表達率85.05％)，MMP-9385ng/mL組(表達率87.54％)，MMP-9770ng/mL組(表達率69.96％)，MMP-91155ng/mL組(表達率65.06％)。表明MMP-9對SW1116細胞表面TNFR1表達有下調(diào)作用且

11、與劑量有一定的關(guān)系。 三、MMP-9作用不同時間后對TNFR1表達的影響：在固定MMP-9770ng/mL濃度，不同作用時間條件下，0h組(表達率86.36％)，1.5h(表達率83.88％)，3h(表達率67.68％)，6h(表達率18.08％)，9h(表達率14.38％)。表明MMP-9對SW1116細胞表面TNFR1表達的下調(diào)作用與時間有一定的關(guān)系。 四、當時間固定為3h，不同濃度的MMP-9作用后，SW1116細

12、胞培養(yǎng)上清中sTNFR1表達量的變化：ELISA定量檢測結(jié)果顯示，MMP-9Ong/mL組，sTNFR1的量為28.70pg/mL；MMP-9154ng/mL組，sTNFR1的量為33.67pg/mL；MMP-9385ng/mL組，sTNFR1的量為28.66pg/mL；MMP-9770ng/mL組，sTNFR1的量為130.23pg/mL；MMP-91155ng/mL組，sTNFR1的量為137.09pg/mL。表明MMP-9促進SW

13、1116細胞表面TNFR1脫落形成sTNFR1且與劑量有一定的關(guān)系。 五、當MMP-9濃度固定為770ng/mL，MMP-9作用不同時間后細胞培養(yǎng)上清中sTNFR1量的變化：ELISA定量檢測結(jié)果顯示，0h組sTNFR1的量為28.69pg/mL；1.5h組sTNFR1的量為49.34pg/mL；3h組sTNFR1的量為130.23pg/mL；6h組sTNFR1的量為176.36pg/mL；9h組sTNFR1的量為189.36p

14、g/mL。表明MMP-9促進SW1116細胞表面TNFR1脫落形成sTNFR1且與時間有一定的關(guān)系。 六、MMP-9作用前后SW1116細胞TNFR1的表達與細胞培養(yǎng)上清中sTNFR1的關(guān)系：經(jīng)線性相關(guān)分析顯示兩者呈明顯負相關(guān) 結(jié)論 一、大腸癌細胞株表達TNFR1 二、MMP-9促進SW1116細胞表面TNFR1脫落形成sTNFR1，但有劑量和時間依賴性。MMP-9下調(diào)大腸癌細胞表面TNFR1的表達，可能