腫瘤壞死因子受體Ⅱ在視網膜新生血管發(fā)生發(fā)展及細胞凋亡中的作用機制研究.pdf

1、腫瘤壞死因子受體II(Tumor necrosis factor2,TNFR2)是腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)受體蛋白大家族的主要成員，參與許多生理及病理性過程，在細胞生長、激活、生存和遷移等方面都起到了重要作用。目前，關于它的研究主要集中于淋巴細胞。新生血管發(fā)生是許多疾病的主要病理特征和嚴重并發(fā)癥，包括眼部血管性疾病和腫瘤等。然而，目前關于TNFR2在血管內皮細胞以及血管發(fā)生發(fā)展中的生理和病理作用

2、研究很少。因此，本研究以視網膜血管為切入點，以氧誘導視網膜病變模型為主要方法，觀察了TNFR2在視網膜血管系統(tǒng)的發(fā)育、新生血管發(fā)生以及高氧誘發(fā)的血管退縮/生長停滯中的作用；同時，通過體外研究探索了TNFR2在內皮細胞增殖、遷移、存活和凋亡中的作用及其作用機制。
　　 第一部分常氧下TNFR2對視網膜血管系統(tǒng)發(fā)育的影響
　　 目的：探索TNFR2是否參與常氧下枧網膜血管系統(tǒng)的發(fā)育。
　　 方法：采用TNFR2基因敲

3、除小鼠(TNFR2-KO)、野生型小鼠(C57BL/6J，B6)和血管內皮細胞特異性高表達TNFR2(VETNFR2)轉基因小鼠，于其出生后不同時間摘取眼球制作視網膜鋪片和石蠟切片，并行血管染色，比較不同時期各種基因型小鼠視網膜血管的生長速度及形態(tài)特征。
　　 結果：TNFR2-KO、B6和VETNFR2小鼠在視網膜血管系統(tǒng)發(fā)育上無顯著差異。生后(Postnatal)第三天(P3)，血管從視乳頭長出，位于視網膜神經纖維層，分布于

4、視乳頭至視網膜邊緣的1/3～1/4范圍。生后第5天(P5)，視網膜血管延伸至視乳頭至視網膜邊緣的1/2范圍。生后第7天(P7)，視網膜血管幾乎到達視網膜邊緣。生后第7天開始，淺層血管逐漸向視網膜深層發(fā)展，依次生成位于外叢狀層的次級血管網和位于內叢狀層外側緣的三級血管網，表層血管網逐漸由最初的多邊形網絡樣結構轉變成喬木樣結構。P7，P9和P11時，三種小鼠的視網膜深層血管發(fā)育速度也相似。
　　 結論：TNFR2對小鼠視網膜血管系統(tǒng)

5、發(fā)育無顯著影響。
　　 第二部分TNFR2在氧誘導視網膜病變模型中的作用研究
　　 目的：探討TNFR2對氧誘導視網膜病變模型中細胞凋亡和新生血管形成的影響。
　　 方法：采用TNFR2-KO、B6和VETNFR2乳鼠，建立氧誘導視網膜病變模型。實驗組(Hyperoxia，H)于生后第7天將乳鼠隨同母鼠置于含氧體積分數為75％的飼養(yǎng)箱中5天，然后回到正常大氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天；對照組一直置于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)(Nor

6、moxia，N)。于P12(出氧箱)時行視網膜鋪片和冰凍切片TUNEL染色比較視網膜中央無血管區(qū)大小及細胞凋亡情況。于P17(新生血管形成最多)時制作視網膜鋪片和眼球石蠟切片，比較深層血管的恢復和視網膜前病理性新生血管的發(fā)生情況；行石蠟切片PCNA和p-P65染色檢測視網膜細胞的增殖以及NF-kB通路的激活；此外，檢測并比較視網膜中炎癥及血管發(fā)生相關因子包括VEGFR2、TNF-α、HIF-1α、Bmx、VEGF-A、AngII、ERK

7、和STAT3的mRNA和/或蛋白水平。
　　 結果：常氧環(huán)境中飼養(yǎng)的各組小鼠視網膜血管形態(tài)均正常。高氧組所有小鼠造模成功，但不同基因型小鼠問存在差異。P12時，與B6小鼠相比，TNFR2-KO小鼠視網膜凋亡細胞數增多，無灌注區(qū)增大；而VETNFR2小鼠其視網膜凋亡細胞數減少，無灌注區(qū)減小。P17時，TNFR2-KO小鼠的無灌注區(qū)最大，B6小鼠和VETNFR2小鼠之間沒有顯著差異；TNFR2-KO小鼠的視網膜深層血管網絡的恢復明顯

8、遲于B6和VETNFR2小鼠；視網膜鋪片及石蠟切片結果顯示B6小鼠的視網膜前新生血管形成較TNFR2-KO小鼠多，但較VETNFR2小鼠少，此結果與PCNA染色結果相一致；同時，出氧箱后相對缺氧誘發(fā)p-P65表達增高，此反應在TNFR2-KO小鼠中減弱并在VETNFR2小鼠中增強。通過RT-qPCR檢測發(fā)現，相對缺氧誘導VGFR2、TNF-α、HIF-1α、Bmx、VEGF-A和AngII的mRNA水平表達增高，并且TNF-α、Bmx和

9、AngII的增高在三種基因型小鼠中存在差異。此外，我們通過western雜交方法發(fā)現相對缺氧激發(fā)VGFR2、HIF-1α、ERK和STAT3的表達增高或活化，并且此反應在TNFR2-KO小鼠中減弱，而在VETNFR2小鼠中增強。
　　 結論：TNFR2表達在氧誘導視網膜病變模型中抑制細胞凋亡，減少無血管區(qū)的形成；促進血管生長因子和炎癥因子的釋放和活化，從而促進細胞增殖和新生血管形成。
　　 第三部TNFR2對血管內皮細胞

10、生長和遷移作用的體外研究
　　 目的：探索TNFR2在肺微血管內皮細胞的生長和遷移中的作用。
　　 方法：分離、培養(yǎng)TNFR2-KO和B6小鼠來源的肺微血管內皮細胞(Murine LungMicrovascular Endothelial Cell，MLEC)，并進行永生化處理。使用WST-1比色法和劃痕損傷試驗檢測并比較兩種細胞的增殖能力和遷移能力。
　　 結果：成功分離、培養(yǎng)并永生化小鼠肺微血管內皮細胞，用免

11、疫組織化學方法鑒定細胞純度。B6小鼠來源的內皮細胞較TNFR2-KO來源的內皮細胞增殖更快，遷移能力更強。缺氧刺激可促進兩種細胞的增殖和遷移能力；TNF刺激增強B6來源細胞的增殖和遷移能力，對TNFR2-KO細胞無明顯影響。
　　 結論：TNFR2在體外促進微血管內皮細胞的生長和遷移。
　　 第四部分TNFR2在細胞存活和凋亡中的作用及機制研究
　　 目的：通過比較TNFR2野生型(TNFR2-WT)和突變型(T

12、NFR2-59)，探索其在細胞(特別是內皮細胞)存活和凋亡中的作用及發(fā)生機制。
　　 方法：使用脂質體轉染或者電穿孔轉染的方法使目的基因高表達，通過AnnexinV/PI染色和細胞計數判定細胞凋亡的程度，Western雜交和報告基因方法檢測TNF信號通路下游各種分子的激活及細胞凋亡信號通路的激活，通過免疫熒光的方法檢測目的蛋白的表達部位及其共定位，此外使用免疫沉淀的方法檢測兩種蛋白的結合狀態(tài)。
　　 結果：TNFR2-W

13、T在細胞膜和細胞質中均有表達，對細胞的性狀無影響；TNFR2-59(TNFR2的羧基端59個堿基缺失)只表達于胞質內，可引起細胞核呈病態(tài)濃縮。Anneixn V/PI染色結果顯示在293T細胞中TNFR2-59過表達可引起細胞凋亡，并在TNF刺激下進一步加重；而TNFR2-WT在TNF誘導的細胞凋亡中起保護作用。Western雜交結果顯示TNFR2-59激發(fā)線粒體依賴性和非依賴性細胞凋亡通路，而TNFR2-WT抑制Caspase家族介導

14、的細胞凋亡通路。究其原因，TNFR2-WT和TNFR2-59介導不同的信號分子激活。報告基因和western雜交結果均證實TNFR2過表達可介導JNK和NF-kB通路的激活，而TNFR2-59只能激活JNK、不能激活與細胞存活相關的NF-kB。隨后，我們發(fā)現TNFR2-WT和TNFR2-59在內皮細胞存活/凋亡中的作用和在293T細胞中相似。并且，兩者在細胞凋亡和TNF信號通路中的作用均依賴于TNFR1。免疫熒光染色顯示在內皮細胞中TN

15、FR1和TNFR2-WT或TNFR2-59均有共定位。免疫沉淀進一步證實TNFR2-WT和TNFR2-59相互結合發(fā)揮作用，而TNFR2的胞內近膜段是其與TNFR1結合的關鍵部位。此外，TNFR2-59參與誘導細胞凋亡的TNFR1復合物II形成，而TNFR2-WT則激活促細胞存活的NF-kB途徑，這很可能是TNFR2-WT和TNFR2-59在細胞存活/凋亡中發(fā)揮不同作用的原因。
　　 結論：表達于細胞膜上的TNFR2通過激活NF