口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因3ABC、3AB、3A的克隆表達(dá)及3A蛋白間接ELISA方法的初步建立.pdf

1、口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要侵害豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物。該病傳播速度快、宿主范圍廣、發(fā)病率高，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病之首。多數(shù)發(fā)展中國(guó)家通過(guò)注射疫苗的辦法來(lái)控制該病的流行，因此如何區(qū)分自然感染動(dòng)物和注射疫苗動(dòng)物是該病防控中迫切解決的問(wèn)題。FMDV感染動(dòng)物既能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋

2、白（SP）抗體也能產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）抗體,而現(xiàn)行滅活疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中大多數(shù)去除了非結(jié)構(gòu)蛋白，因此，動(dòng)物在接種FMDV滅活疫苗后，主要產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體，很少或者不產(chǎn)生NSP抗體。所以，以NSP為抗原，檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)NSP抗體是一種很好的區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的診斷方法。
　　 本文以亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒為研究對(duì)象，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC基因，然后定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32a,重組質(zhì)粒pE

3、T-32a-3ABC轉(zhuǎn)化宿主菌BL21和rosetta，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，證明重組蛋白PET-32a-3ABC成功在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)量較少，經(jīng)過(guò)對(duì)3ABC序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)含有的稀有密碼子較多，約占總數(shù)的30%，可能影響蛋白的表達(dá)。以構(gòu)建的口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC質(zhì)粒pET-32a-3ABC為模板，設(shè)計(jì)特異性的引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到非結(jié)構(gòu)蛋白3AB、3A基因，然后分別定向克隆到原

4、核表達(dá)載體pET-28a、pET-41a兩種載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，證明重組蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot分析具有免疫原性。
　　 本文用純化3A蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)FMDV抗體的間接ELISA方法并確定了ELISA最佳工作條件。此項(xiàng)研究為以FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白為抗原，建立鑒別診斷動(dòng)物自然感染和免疫的間接ELISA方法奠定