檢測(cè)口蹄疫病毒基因芯片技術(shù)與3B-ELISA鑒別診斷方法研究.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouthdisease)是人畜共患的烈性傳染病，病原為口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)，該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)確定為對(duì)動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易有重大影響的A類疾病。預(yù)防和控制口蹄疫的關(guān)鍵是使用免疫效果好的疫苗和快速準(zhǔn)確的診斷方法。傳統(tǒng)的方法有病毒分離、乳鼠接種試驗(yàn)等?；蛐酒墙鼛啄瓿霈F(xiàn)的新技術(shù)，具有快速和靈敏度高的特點(diǎn)，可以應(yīng)用于微生物的檢測(cè)，該特點(diǎn)符合口

2、蹄疫診斷的需要；另外，在臨床實(shí)際中，區(qū)分口蹄疫病毒自然感染和疫苗免疫動(dòng)物的快速鑒別診斷方法對(duì)于該病的控制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為此，本研究開(kāi)展了以下兩個(gè)方面的工作。 1.檢測(cè)口蹄疫病毒基因芯片技術(shù)的研究 本研究根據(jù)O型口蹄疫病毒拓?fù)湫屠碚摵虶enbank上公布的口蹄疫病毒的核酸序列，借助DNAman5.2.2和PrimerPremier5.0生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)了檢測(cè)口蹄疫病毒的6條種屬探針和12條拓?fù)湫吞结?，每個(gè)探針5’端連接

3、12T后氨基修飾，然后通過(guò)點(diǎn)樣、固定、封閉等步驟將探針固定在醛基化玻璃片上制備成檢測(cè)芯片。分別提取5株口蹄疫病毒的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR摻入Cy3-dCTP熒光標(biāo)記后，與芯片上的探針特異性雜交，然后對(duì)芯片進(jìn)行掃描，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，5株口蹄疫病毒均能被檢出，與基因測(cè)序結(jié)果基本一致，表明本法可以用于口蹄疫病毒的檢測(cè)。 2.口蹄疫3B-ELISA鑒別診斷方法的初步建立 從口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)物中提取總RNA

4、，經(jīng)一步法RT-PCR獲得了長(zhǎng)度約230bp的3B基因片段，將PCR產(chǎn)物連接到pMD-18-T載體，獲得重組質(zhì)粒并測(cè)序，用BamHⅠ與HindⅢ雙酶切此重組質(zhì)粒后，回收3B基因并連接到pGEX-KG載體上形成表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-3B，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，篩選陽(yáng)性重組工程菌；重組蛋白在27℃下，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交，結(jié)果表明3B基因主要以可溶形式高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性。以純化的

5、表達(dá)產(chǎn)物為抗原建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(I-ELISA)方法。方陣滴定確定最佳包被濃度是6.1μg/孔，最佳血清稀釋倍數(shù)為1：80；通過(guò)測(cè)定36份FMDV陰性血清，確定了該方法的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。特異性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好；用3B-ELISA方法與美國(guó)聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司(UBI)生產(chǎn)的合成肽檢測(cè)試劑盒UBI(R)FMDVNS-ELISA對(duì)比檢測(cè)44份血清，符合率為87.1％。證明3B-ELISA方法可用于口蹄疫的鑒