基于口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3AB的ELISA鑒別檢測方法的研究.pdf

1、口蹄疫( Foot-and-mouth disease, FMD )是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的偶蹄動物共患的、接觸性傳染病。FMDV有七種血清型、七十多種亞型,變異性強(qiáng),給病毒的防治造成很大困難。它可導(dǎo)致國家的畜產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易受限,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和政治影響。因此,建立準(zhǔn)確、快捷的區(qū)分感染活病毒(發(fā)病或注射弱毒疫苗)和注射滅活疫苗動物的診斷方法,在檢測和防止FMD的發(fā)生

2、、活畜檢疫等方面都是十分迫切需要的。以口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3AB作為抗原的ELISA,適用于鑒別診斷感染和注苗動物。以3ABC基因片斷為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了684bp的3AB基因片斷,與pET32а(+)連接后,轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3) plysS,待菌體濃度為0.8OD550時,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果表明,3AB基因得到了正確表達(dá),表達(dá)的重組3AB蛋白為非溶性融合蛋白,分子量約為5

3、0Kda。ELISA結(jié)果顯示,重組3AB蛋白可用于豬、牛口蹄疫病毒感染與疫苗免疫抗體的鑒別診斷。重組口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3AB作為檢測抗原包被酶標(biāo)板反應(yīng)孔,以辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白A/G作為第二抗體,建立了抗非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測的方法。結(jié)果表明,在1746份免疫豬血清中,3AB-ELISA對免疫豬血清的特異性為98.68%；在1077份健康非免疫豬血清中,3AB-ELISA對健康非免疫豬血清的特異性為97.96%；在36份人工感染豬

4、血清中,3AB-ELISA對陽性檢出率為100%。而牛特異性的各項(xiàng)指標(biāo)分別為94.04%,97.96%和陽性檢出率為100%。進(jìn)一步改進(jìn)了3AB-ELISA檢測方法,使用了脫脂奶粉和大腸桿菌裂解液做為該方法的阻斷劑,有效降低了背景值,消除了非特異性反應(yīng)。采用TMB作顯色劑,對檢測環(huán)境的要求比OPD的更寬,使該檢測方法的實(shí)用性更好。同時,3AB-ELISA與國外同類試劑盒比較,對陽性牛血清檢出率,3AB-ELISA的陽性率為91.7%,U