原核注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠的技術(shù)優(yōu)化.pdf

1、轉(zhuǎn)基因小鼠（Mus musculus）的制備方法多種多樣，包括原核顯微注射、精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因、體細(xì)胞核移植和使用慢病毒載體等。但目前為止，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠最為有效的方法仍然是原核注射技術(shù)。單從效果來看，原核注射技術(shù)是最為理想的。但此項技術(shù)也存在著不足:很多研究人員在實驗室中得到的轉(zhuǎn)基因效率并不一致，并且轉(zhuǎn)基因效率低。為此，本文從注射針直徑、外源基因濃度、單/雙核注射等原核注射環(huán)節(jié)入手，對原核注射技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并采用優(yōu)化后的技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠

2、。試驗結(jié)果，注射針的直徑大約為0.5μm時是最合適的，相比直徑1μm的陽性率(12.5％)，其陽性率(47.7％)要高出35％(P＜0.01)。外源性基因的濃度，是影響轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率的重要因素。外源基因濃度為1.00μg/mL、2.50μg/mL、3.00μg/mL和4.0μg/mL時，轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率分別0.67％、14.9％、30.6％和21.4％。當(dāng)外源性基因濃度為3.00μg/mL時，陽性率遠(yuǎn)高于其他組(P＜0.01)。使用濃

3、度為3.00μg/mL的外源基因濃度，分別統(tǒng)計并比較單原核注射與雙原核注射的陽性率，結(jié)果表明雙原核注射組的陽性率(24.3％)比單原核注射組(18.3％)明顯要高(P＜0.01)。在顯微技術(shù)輔助作用下，將2-細(xì)胞時期胚胎分別移入到0.5d、1.5d、2.5d假孕母鼠輸卵管內(nèi)，19.5d后代孕母鼠產(chǎn)仔，產(chǎn)仔率分別為68.6％、67.6％和40.1％，經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)基因陽性率為17.4％、22.5％和10.1％。組間對比結(jié)果表明，在產(chǎn)仔率指標(biāo)方