運用顯微注射法和體內(nèi)電穿孔法制備胰蛋白酶原Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠的研究.pdf

1、進行胰腺外分泌功能研究是為了從生理角度觀察胰腺正常分泌過程或從病理生理角度來探討胰腺相關(guān)疾病的發(fā)病機制。胰腺外分泌部分泌的消化酶中胰蛋白酶以酶原形式釋放。胰蛋白酶原是一個觸發(fā)酶，可以激活胰液中許多其他的酶原，在消化過程中起關(guān)鍵作用。胰蛋白酶原分為胰蛋白酶原Ⅰ和胰蛋白酶原Ⅱ，其中胰蛋白酶原Ⅱ的分泌量在急性胰腺炎時比正常升高約50倍，因而胰蛋白酶原Ⅱ分泌量的變化是急性胰腺炎靈敏、特異的標志和檢測指標。檢測胰蛋白酶原Ⅱ分泌量的變化可用于急性胰

2、腺炎的診斷及其嚴重程度的評價。 本課題的目的在于建立一種能夠觀察胰腺外分泌功能的轉(zhuǎn)基因動物，借助該動物模型通過檢測活體內(nèi)胰蛋白酶原Ⅱ表達水平變化(升高或降低)以監(jiān)測胰腺外分泌相關(guān)疾病(如胰腺炎、胰腺癌)的發(fā)生或治愈，從而為研究胰腺外分泌功能的生理機理和與其相關(guān)的疾病發(fā)病機制以及篩選治療上述疾病的藥物提供理想的實驗體系。 本研究分別運用顯微注射法和曲細精管內(nèi)注射輔之體內(nèi)電穿孔法來制備胰蛋白酶原Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠。 本實驗

3、室以質(zhì)粒pEGFP-N1為載體，構(gòu)建以大鼠彈性蛋白酶Ⅰ啟動子(PEL)驅(qū)動胰蛋白酶原Ⅱ信號肽(Pre)、并連接有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的載體質(zhì)粒pPEL-Pre-EGFP。為獲取轉(zhuǎn)基因目的片斷，本研究對已構(gòu)建的載體進行酶切鑒定、測序、比對分析，并轉(zhuǎn)染體外細胞進行功能性檢測。 pPEL-Pre-EGFP的酶切和測序鑒定通過三酶切pPEL-Pre-EGFP獲得轉(zhuǎn)基因用片段PEL-Pre-EGFP(2308bp)，經(jīng)測

4、序、比對分析，PEL、Pre和EGFP均與GenBank中所提交序列同一性程度極高，表明其構(gòu)建正確。 pPEL-Pre-EGFP功能性體外檢測將轉(zhuǎn)染劑與pPEL-Pre-EGFP混合轉(zhuǎn)染SW1990細胞株(人胰腺癌細胞株)，24h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，預(yù)示外源基因在SW1990上能夠正常表達，這為下一步制備轉(zhuǎn)基因動物奠定了基礎(chǔ)。 顯微注射法制備PEL-Pre-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠本研究共取受精卵1610枚，其中可用

5、于顯微注射用的受精卵1280枚，注射DNA后成活的受精卵共507枚；每只假孕雌鼠移植約20個受精卵，共移植24只假孕雌鼠，其中7只懷孕，妊娠率為29.2％，共獲得F0代小鼠18只，出生率為3.6％；F0代小鼠經(jīng)檢測，PCR陽性6只，SouthernBlotting陽性1只(雄性)，SouthernBlotting陽性率為5.6％。 體內(nèi)電穿孔法制備PEL-Pre-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠通過曲細精管內(nèi)注射輔之體內(nèi)電穿孔法共獲得10只雄

6、鼠，2周后從與之交配的20只雌鼠(1♂：2♀)中獲得妊娠雌鼠14只，妊娠率70％，產(chǎn)下仔鼠115只；F0代小鼠經(jīng)檢測，PCR陽性7只，SouthernBlotting陽性1只(雄性)，SouthernBlotting陽性率0.87％。 EGFP可視化檢測獲得的2只Southern雜交陽性鼠經(jīng)暴露胰腺組織部位，在整體成像儀下僅顯微注射法獲得的陽性小鼠胰腺組織觀察到綠色熒光，將其胰腺組織制作冰凍組織切片，在倒置相差熒光顯微鏡下可觀測