日本血吸蟲疫苗聯(lián)合應(yīng)用及體內(nèi)電穿孔技術(shù)的研究.pdf

1、血吸蟲病仍然是一種嚴(yán)重危害流行區(qū)人民健康的重要公共衛(wèi)生問題。我國(guó)每年要投入大量的人力、物力和財(cái)力防治血吸蟲病，雖取得了一定的效果，但由于血吸蟲保蟲宿主多，中間宿主釘螺分布廣且難以消滅，再感染頻繁發(fā)生，血吸蟲病的流行形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻。上世紀(jì)70年代吡喹酮的問世，對(duì)血吸蟲病具有良好的治療效果，DNA疫苗作為一種劃時(shí)代的新技術(shù)，在抗血吸蟲感染領(lǐng)域已進(jìn)行了大量研究，顯示了良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)磷酸丙糖異構(gòu)酶(TP

2、I)和23kDa膜蛋白的DNA疫苗，同時(shí)還構(gòu)建了TPI和日本血吸蟲抗獨(dú)特型抗體NP30 CDR3區(qū)6倍重復(fù)表位基因(CDR3)6的雙價(jià)DNA疫苗，均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得一定的保護(hù)作用，但保護(hù)力并不理想，減蟲率均未穩(wěn)定達(dá)到50％以上。本研究擬通過制備日本血吸蟲雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗，并通過兩者聯(lián)合免疫觀察免疫保護(hù)效果；在此基礎(chǔ)上再應(yīng)用體內(nèi)電穿孔技術(shù)來(lái)提高雞尾酒式DNA疫苗的轉(zhuǎn)染效率，以進(jìn)一步提高其免疫保護(hù)效果，同時(shí)對(duì)其作用的機(jī)理進(jìn)行初步

3、探討。研究?jī)?nèi)容主要包括：一、日本血吸蟲雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)免疫保護(hù)作用的研究大量制備質(zhì)粒DNA：pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-SjC23、pcDNA 3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR 3)6，同時(shí)制備重組蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30。以質(zhì)粒DNA pcDNA 3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6等量混合后即為雞尾酒式DNA疫苗；

4、重組蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30等量混合后即為雞尾酒式蛋白疫苗。70只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E5組，每組14只。A組為自然感染組；B組(空質(zhì)粒對(duì)照組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μ1 pcDNA3.1質(zhì)粒DNA；C組(空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl pcDNA3.1質(zhì)粒DNA，第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100μ1雞尾酒式蛋白疫苗+1

5、00μ1福氏完全佐劑(FCA)；D組(雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗；E組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μlFCA。DNA免疫組末次免疫后4周，蛋白加強(qiáng)組末次免疫后2周，所有小鼠同時(shí)經(jīng)腹部皮膚感染40±1條日本血吸蟲尾蚴。攻擊感染后42

6、 d剖殺，計(jì)數(shù)成蟲數(shù)及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清檢測(cè)IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2a，感染前2d取小鼠脾臟制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，檢測(cè)脾細(xì)胞經(jīng)刀豆蛋白(ConA)和日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原(SEA)刺激后細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN—γ的水平。雞尾酒式DNA疫苗、雞尾酒式蛋白疫苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體，C、D組和E組的A450值分別為1.956±0.005、1.374±0

7、.810、2.162±0.162，與對(duì)照組相比，C、D、E組的IgG抗體水平均顯著升高(P均<0.01)，E組的IgG抗體水平顯著高于C組(P<0.05)和D組(P<0.01)，抗體亞類IgG2a/IgG1的比值分別為0.525、1.829和0.712。D、E兩組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ含量較空質(zhì)粒對(duì)照組均有明顯升高，IL-4則無(wú)明顯差異。本實(shí)驗(yàn)表明，雞尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用，具有顯著的正協(xié)同作用，雞尾酒式蛋

8、白疫苗可顯著增強(qiáng)雞尾酒式DNA疫苗的免疫保護(hù)作用。二、體內(nèi)電穿孔增強(qiáng)日本血吸蟲核酸疫苗免疫保護(hù)作用的研究在第一部分實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提高其免疫保護(hù)作用，擬通過采用體內(nèi)電穿孔的免疫方法，探討該免疫方法在提高免疫保護(hù)作用中的效能。制備雞尾酒式DNA疫苗和雞尾酒式蛋白疫苗同第一部分。70只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組，每組14只。A組為自然感染組；B組(電穿孔空質(zhì)粒對(duì)照組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射

9、100μl pcDNA 3.1質(zhì)粒DNA，每次DNA注射后即輔以體內(nèi)電穿孔；C組(電穿孔空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)空質(zhì)粒免疫與體內(nèi)電穿孔同B組，但于第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐劑(FCA)；D組(電穿孔雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別在第0、3、6周經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，每次DNA疫苗免疫后即輔以體內(nèi)電穿孔；E組(電穿孔雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)雞尾酒式

10、DNA免疫與體內(nèi)電穿孔同D組，但于第9周每鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA。DNA免疫組末次免疫后4周，蛋白加強(qiáng)組末次免疫后2周，所有小鼠同時(shí)經(jīng)腹部皮膚感染40±1條尾蚴。攻擊感染后42 d剖殺小鼠，計(jì)數(shù)成蟲及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清檢測(cè)IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2a，并取小鼠脾臟制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，脾細(xì)胞經(jīng)ConA和SEA刺激后，采用流式細(xì)胞儀

11、檢測(cè)上清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組(A組)，C、D和E組的減蟲率分別為18.09％、45.00％和57.09％，D組和E組的減蟲率均顯著高于C組(P均<0.01)，且E組的減蟲率顯著高于D組(P<0.05)；C、D組和E組的減卵率分別為12.49％、50.88％和59.26％，D組和E組的減卵率均顯著高于C組(P均<0.01)，且E組的減蟲率顯著高于D組(P<0.05)。C、D、E 3組小鼠血

12、清都檢測(cè)到特異性IgG抗體，抗體亞類IgG2a/IgG1比值分別為0.394、3.518、0.914。D、E兩組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN—γ含量較對(duì)照組均有明顯升高，IL-4則無(wú)明顯差異。本實(shí)驗(yàn)顯示，體內(nèi)電穿孔技術(shù)可顯著提高日本血吸蟲核酸疫苗的免疫保護(hù)作用。三、日本血吸蟲核酸疫苗體內(nèi)電穿孔法的進(jìn)一步研究為進(jìn)一步探索體內(nèi)電穿孔技術(shù)增強(qiáng)血吸蟲核酸疫苗免疫保護(hù)作用的穩(wěn)定性、可靠性及可重復(fù)性，為此進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證該免疫

13、方法的可行性。日本血吸蟲“雞尾酒式”DNA疫苗和蛋白疫苗的制備同前。96只5—6周齡的BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分成A、B、C、D、E、F、G、H8組，每組12只，其中A組(空質(zhì)粒對(duì)照組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl pcDNA 3.1質(zhì)粒DNA；B組(電穿孔空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl pcDNA 3.1質(zhì)粒DNA，每次DNA疫苗免疫后即輔以體內(nèi)電穿

14、孔，于第9周每只小鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐劑(FCA)；C組(雞尾酒式DNA疫苗組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗；D組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，于第9周每只小鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA；E組(電穿孔雞尾酒式DNA疫苗組

15、)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，每次DNA免疫后即進(jìn)行體內(nèi)電穿孔；F組(電穿孔雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μl雞尾酒式DNA疫苗，每次DNA免疫后即進(jìn)行體內(nèi)電穿孔，但于第9周每只小鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100μl雞尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA；G組(TPI組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μlpcDN

16、A3.1-SjCTPI質(zhì)粒DNA；H組(電穿孔TPI組)每只小鼠分別于第0、3、6周麻醉下經(jīng)股四頭肌注射100μlpcDNA3.1-SjCTPI質(zhì)粒DNA，每次DNA免疫后即進(jìn)行體內(nèi)電穿孔。DNA疫苗末次免疫后4周，蛋白疫苗加強(qiáng)免疫后2周，所有小鼠同時(shí)經(jīng)腹部皮膚感染40±1條尾蚴。攻擊感染后42d剖殺小鼠，計(jì)數(shù)各小鼠成蟲數(shù)和肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2 d及感染前2 d分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清檢測(cè)IgG抗體水平、抗體亞類IgG1及IgG2

17、a，并取小鼠脾臟制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，脾細(xì)胞經(jīng)ConA和SEA刺激后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。結(jié)果與上次實(shí)驗(yàn)基本相符，B—H實(shí)驗(yàn)組的減蟲率分別為14.77％、32.54％、43.95％、41.47％、59.38％、27.23％和42.37％，相對(duì)于對(duì)照組(A組)檢獲的成蟲數(shù)均顯著降低(P均<0.01)，D組(雞尾酒式DNA與蛋白疫苗聯(lián)合免疫組)的減蟲率顯著高于C組(雞尾酒式DNA疫苗組)和B組

18、(電穿孔空質(zhì)粒+雞尾酒式蛋白疫苗對(duì)照組)(P值分別為<0.01和<0.05)，經(jīng)SEA特異性刺激后，各實(shí)驗(yàn)組的IL-2和IFN-γ水平較對(duì)照組明顯升高，而IL-4則未檢測(cè)到。本研究再次表明，DNA疫苗通過體內(nèi)電穿孔再結(jié)合蛋白疫苗的聯(lián)合應(yīng)用可較大程度的提高免疫保護(hù)作用，減蟲率、減雌率及肝臟的減卵率均達(dá)到接近60％和60％以上，表明該免疫方法具有較好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，是一種較理想而且可行的血吸蟲病免疫策略。進(jìn)一步的研究將進(jìn)行大動(dòng)物保護(hù)性試