日本血吸蟲TOR分子DNA疫苗和RNA干擾研究.pdf

1、血吸蟲病是一種慢性消耗性寄生蟲病，嚴重影響發(fā)展中國家的公共衛(wèi)生安全。日本血吸蟲病在我國南方廣泛流行，對人民身體健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)等造成了重大損害。血吸蟲具有免疫逃避特性，可在宿主體內(nèi)長期存活。補體的溶細胞作用是機體抵抗病原微生物及人體寄生蟲感染的重要防御機制。血吸蟲具有多種調(diào)節(jié)宿主補體活性的機制。研究表明，四跨膜孤兒受體(TOR)蛋白是一種位于血吸蟲體被表面的補體C2抗原受體，可以通過結(jié)合補體C2a分子抑制補體活性。
　　本文利用P

2、CR技術擴增到日本血吸蟲SjTOR完整的蛋白編碼區(qū)1245bp，將其克隆到pXJ40-FLAG載體的HindⅢ、XhoⅠ酶切位點，成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細胞中進行表達，轉(zhuǎn)染48 h后，應用間接免疫熒光染色可觀察到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞有特異性綠色熒光，空質(zhì)粒對照則未見。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pXJ40-FLAG-TOR質(zhì)粒6h后SjTOR基因已有轉(zhuǎn)錄，至轉(zhuǎn)染24 h時轉(zhuǎn)錄

3、水平最高，隨后開始降低。Western blot結(jié)果顯示SjTOR蛋白分子量約53kDa，可被抗FLAG單抗和抗rSjTOR-ED1抗血清識別。結(jié)果表明SjTOR蛋白可以在293T細胞中表達。
　　以構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pXJ40-FLAG-TOR為基礎大量制備DNA疫苗，分別利用肌肉注射法和電導入法免疫昆明系和BALB/c小鼠。在昆明鼠中，和空白質(zhì)粒對照組相比，用電導入法免疫DNA疫苗誘導了25％的減蟲率和28.87％的減卵率;肌

4、肉注射法誘導了0.12％的減蟲率和42.38％的減卵率。在BALB/c小鼠中，和空白質(zhì)粒對照組相比，用電導入法免疫DNA疫苗獲得了22.58％的減蟲率和32.6％的減卵率;而肌肉注射法獲得了20.58％的減蟲率和51.34％的減卵率。ELISA結(jié)果表明電導入法免疫在昆明系和BALB/c小鼠均誘導了較高水平的特異性IgG抗體，且至剖殺時依然保持較高水平，而肌肉注射法免疫小鼠后特異性IgG抗體水平?jīng)]有明顯升高。電導入法免疫的昆明系和BALB

5、/c小鼠特異性IgG1抗體水平都沒有升高，而肌肉注射法免疫后均有顯著升高。和對照組相比，各免疫組小鼠的IgG2a抗體水平升高均不明顯。液相芯片技術檢測免疫組小鼠血清細胞因子水平，結(jié)果與PBS對照組相比，肌注免疫和電導入法免疫BALB/c和昆明系小鼠可誘導其血清IL-12和IFN-γ水平升高，IL-4和IL-10水平則降低。結(jié)果表明，pXJ40-FLAG-TORDNA疫苗免疫可能誘導了趨向Th1型的免疫應答。
　　根據(jù)SjTOR基因

6、設計和合成了4對siRNA分子。在培養(yǎng)的293T細胞中共轉(zhuǎn)染siRNA和pXJ40-FLAG-TOR質(zhì)粒，實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示S1、S2、S3、S4 siRNA分子分別誘導SjTOR基因轉(zhuǎn)錄水平降低了70％、63％、3.63％、43％。將S1、S2、S4 siRNA分子通過小鼠尾靜脈注射進行體內(nèi)RNA干擾試驗，結(jié)果與DEPC H2O組相比， siRNA誘導SjTOR基因的轉(zhuǎn)錄水平分別下降84.7％、80.9％和23％。蟲荷數(shù)和

7、肝臟組織蟲卵數(shù)分別減少了6.07％和10.06％、24.24％和44.27％、14.02％和63.18％。結(jié)果表明，特異的siRNA分子可以在體內(nèi)干擾SjTOR基因的表達，在小鼠體內(nèi)誘導顯著的減蟲減卵率。
　　綜上，本文構(gòu)建的pXJ40-FLAG-TOR真核表達質(zhì)?？梢栽谡婧思毎斜磉_，免疫小鼠可以誘導趨向Th1型的免疫反應和顯著的免疫保護效果。利用S4 siRNA分子進行的RNA干擾試驗結(jié)果說明，SjTOR基因可能在日本血吸蟲免