日本血吸蟲疫苗的研究——提高疫苗免疫效果的探索和血吸蟲雌雄蟲轉(zhuǎn)錄譜分析研究.pdf

1、血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病,我國(guó)現(xiàn)行的防治策略不能有效地控制該病的流行,迫切需要研究并提出新的防治技術(shù).為此,血吸蟲病疫苗研究備受關(guān)注.圍繞這一主題,本博士后工作主要集中在從技術(shù)策略上探索提高血吸蟲疫苗免疫保護(hù)力的可能途徑,如構(gòu)建粘膜免疫用疫苗;構(gòu)建血吸蟲抗原表位和乙型肝炎核心抗原融合的家蠶表達(dá)轉(zhuǎn)移載體;開展多價(jià)疫苗研究等.同時(shí),開展日本血吸蟲基因表達(dá)譜的研究,為尋找新的具有免疫保護(hù)作用的疫苗候選分子提供基礎(chǔ).具體研究工作

2、如下. 1.Sj.28GST抗原表位與CTB融合基因構(gòu)建、表達(dá)及其免疫效果研究霍亂毒素B亞基(cholera.toxin B subunit,CTB)是良好的免疫佐劑和載體蛋白,本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了可表達(dá)CTB的原核表達(dá)質(zhì)粒,并同Sj.28GST抗原表位融合表達(dá),檢測(cè)該種粘膜疫苗的免疫保護(hù)效果.為了在大腸桿菌中表達(dá)霍亂毒素B亞單位,將ctb基因片段轉(zhuǎn)入Novagen公司的原核表達(dá)質(zhì)粒.pET-30a(+),并在3'端融合表達(dá)六個(gè)Hi

3、s,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-CTB.將表達(dá)質(zhì)粒pET-CTB轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá).SDS-PAGE電泳分析表明重組蛋白以包涵體形式表達(dá),分子量大小約為14KD.重組蛋白變性后利用His柱進(jìn)行純化.Western印記檢測(cè)重組蛋白能夠被抗CT抗體所識(shí)別,具有較好的抗原性.ELISA實(shí)驗(yàn)顯示重組蛋白能與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合,表明其具有CTB的生物學(xué)活性. 為了構(gòu)建含有編碼CTB和日本血吸蟲Sj.28kdGS

4、T抗原表位核苷酸序列的原核表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌中表達(dá),分析Sj.28GST的表位分布,合成了Sj.28GST的4個(gè)抗原表位簇,再將它們同CTB亞單位基因融合,得到了編碼四個(gè)Sj.28GST抗原表位及CTB的重組基因.轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá),對(duì)重組蛋白進(jìn)行western分析,表明重組菌株表達(dá)了CTB和SJ.28GST表位蛋白,表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在.將實(shí)驗(yàn)鼠分為10組,每組10只,包括rSJ.28GST、rCTB和rSj.

5、28GST+rCTB、rCTB-Sj.28GST灌胃免疫組,以及rSj.28GST、rCTB、rCTB-Sj.28GST和rSj.28GST+rCTB皮下免疫組,PBS灌胃及皮下對(duì)照組.在第4次免疫后1周,經(jīng)腹部感染日本血吸蟲尾蚴40±1條,45d后解剖觀察減蟲率和減卵率.結(jié)果,rCTB-Sj.28GST灌胃及皮下免疫組減蟲率分別為28.6﹪及17.7﹪,每克肝減卵率分別為46.3﹪及21.3﹪.用表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)口服免疫小鼠后,所產(chǎn)生的對(duì)日

6、本血吸蟲的免疫保護(hù)力明顯高于用單獨(dú)的重組Sj.28GST免疫的小鼠所產(chǎn)生的免疫力,所表達(dá)的融合蛋白中CTB可能起到了免疫佐劑的作用,增強(qiáng)了SJ.28GST的免疫原性. 2.日本血吸蟲抱雌溝蛋白編碼基因的克隆與誘導(dǎo)表達(dá)條件的研究日本血吸蟲抱雌溝蛋白編碼基因(Gynecophoral canal protein,GCP)是雄蟲差異表達(dá),同血吸蟲雌雄蟲合抱、雌蟲發(fā)育、成熟、產(chǎn)卵相關(guān)的基因.本文于該序列開放閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物并分別引入X

7、holⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn),以原有的SjGCP/pGME-T為模板,用PCR法擴(kuò)增出目的基因片段.再用雙酶切法克隆入表達(dá)載體pGEX-6p-1.比較不同濃度IPTG誘導(dǎo)劑、不同誘導(dǎo)表達(dá)溫度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間等對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響.結(jié)果:用PCR法擴(kuò)增出目的基因片段約1950bp,開放閱讀框長(zhǎng)1932 bp,編碼643個(gè)氨差酸,理論分子量為62KDa.DNA序列分析顯示,與已報(bào)道Sj.GCP序列相同.重組質(zhì)粒SjGCP/pGEX-6p-

8、1高效表達(dá)融合蛋白,但在0.01 mmol/L-2.0 mm01/L的IPTG濃度、15℃-37℃誘導(dǎo)表達(dá)溫度和0.5-16小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間范圍內(nèi),rSjGCP/pCEX都以不溶性包涵體形式表達(dá).遂采用分離、洗滌、變性溶解的方法,結(jié)合分子篩層析和親和層析,對(duì)重組融合蛋白包涵體進(jìn)行了純化.同時(shí),構(gòu)建了Sj.GCP的核酸疫苗pcMV-Sj.GCP,測(cè)序表明,和實(shí)驗(yàn)構(gòu)想一致. 3.日本血吸蟲多價(jià)疫苗的研制和免疫效果評(píng)估多價(jià)疫苗是否具有

9、協(xié)同免疫保護(hù)作用,觀察三種重組的日本血吸蟲抗原蛋白:28KDa谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶rsj.28GST(glutathione S t:ransferase,S j.28GST)、日本血吸蟲23KDa,膜蛋白大親水端(23kDa membrane protein large hydrophilicdomain, L,HD-Sj23)、rSjGCP及三種核酸疫苗組合(VRl012-Sj.28GST,VRl012-L.HD-Sj2 3,pcMV-

10、rSjGCP)免疫小鼠誘導(dǎo)的抗血吸蟲的保護(hù)性免疫效果,探索日本血吸蟲重組抗原rSj.28GST的優(yōu)選免疫次數(shù).將小鼠分為13組,每組10只,分別用不同的疫苗免疫,重組蛋白以佐劑206作為佐劑.同時(shí)設(shè)PBS和佐劑206對(duì)照組.最后一次免疫后,每鼠攻擊40±1條日本血吸蟲尾蚴,42天剖殺.結(jié)果,各免疫組回收蟲體數(shù)均有下降,從6﹪到39﹪不等,肝臟蟲卵計(jì)數(shù)顯示,各免疫組蟲卵數(shù)也均有所下降,減卵率從24.0﹪-47﹪不等,其中以DNA混合疫苗組

11、減蟲和減卵幅度最大,分別為減蟲率39﹪(P<0.05),減卵率47﹪(P<0.05).三價(jià)疫苗免疫小鼠和二價(jià)或單價(jià)疫苗一樣,都能誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)血吸蟲攻擊感染的部分免疫保護(hù)力,但未見明顯提高免疫保護(hù)力.用重組的Sj.28GST一次、二次、三次免疫動(dòng)物,都可誘導(dǎo)顯著的保護(hù)效果,三次免疫獲得的保護(hù)效果略高于一次、二次免疫組,但差異不顯著. 4.家蠶表達(dá)日本血吸蟲保護(hù)性抗原表位和乙型肝炎核心抗原融合蛋白的研究. 乙肝核心抗原(HBc

12、Ag)具有很強(qiáng)的免疫原性,可用來增強(qiáng)自身免疫原性不強(qiáng)的外源抗原決定簇的免疫作用,本文利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出人乙肝核心抗原(HBcAg)全基因,構(gòu)建含HBcAg基因的質(zhì)粒;通過突變的方法,使得HBcAg的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)c/el80-81位含有SalI酶切位點(diǎn),以便融合其他的外源基因.構(gòu)建含突變的HBcAg基因的家蠶表達(dá)轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-His-HbcAg;分析Sj.23kd膜蛋白基因、Sj.GCP以及Sj.28GST基因的抗原表位基因,利

13、用PCR技術(shù)擴(kuò)增這些抗原表位核苷酸序列,通過粘末端連接的方法,將它們分別與HBcAg的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)c/el 80-81位融合,構(gòu)建家蠶表達(dá)轉(zhuǎn)移載體.測(cè)序分析,這些抗原表位核苷酸序列同HBcAg基因融合,得到了3個(gè)含日本血吸蟲抗原表位并融合HBcAg基因的家蠶表達(dá)轉(zhuǎn)移載體,為利用HbcAg作為免疫載體蛋白研制抗血吸蟲病疫苗提供了基礎(chǔ). 5.血吸蟲性別發(fā)育過程中的基因表達(dá)譜分析為獲得新的血吸蟲疫苗候選分子,對(duì)本課題組利用血吸蟲雌雄蟲c

14、DNA消減文庫中的cDNA克隆制備的cDNA芯片進(jìn)行雜交,研究分析血吸蟲雄雌蟲發(fā)育過程中基因表達(dá)譜的變化.芯片質(zhì)量分析顯示,在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后,試驗(yàn)所采用的芯片雜交方法有較好的重復(fù)性和一致性.分析結(jié)果表明,該芯片3082個(gè)克隆中有2474個(gè)呈現(xiàn)雌、雄蟲差異表達(dá).其中雄蟲高表達(dá)1102個(gè),雌蟲高表達(dá)1372個(gè).這些差異表達(dá)基因在血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體上也呈現(xiàn)不同表達(dá)水平.雌、雄蟲高表達(dá)的基因分析表明,雄蟲高表達(dá)的基因在14天到17天

15、就出現(xiàn)變化,雌蟲高表達(dá)的基因則大都在20天到24天之間發(fā)生變化.測(cè)序的1117個(gè)cDNA片段分屬562個(gè)不同基因.其中有206個(gè)在雄蟲中高表達(dá),256個(gè)在雌蟲中高表達(dá),100個(gè)在雌雄蟲中mRNA水平相當(dāng).芯片聚類分析獲得了一些表達(dá)時(shí)相一致的基因和不同時(shí)間高表達(dá)的基因.用熒光定量RT-PCR對(duì)芯片雜交的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證,顯示芯片結(jié)果可信、準(zhǔn)確.正在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步挖掘,從基因的功能、參與的生物學(xué)過程以及細(xì)胞組成等方面發(fā)現(xiàn)了解發(fā)育過程中的現(xiàn)象