卵巢內(nèi)直接注射法制備轉基因小鼠的分子機理研究.pdf

1、卵巢內(nèi)直接注射外源質(zhì)粒DNA，可以高效獲得轉基因小鼠等動物。但有關質(zhì)粒DNA是如何進入卵巢中的卵母細胞并整合到其染色體中的，這一過程目前尚無直接的實驗證據(jù)。本文針對上述問題進行了詳細研究。 在卵巢內(nèi)直接注射質(zhì)粒pIRES-EGFP 24hr后，取出實驗組小鼠的卵巢，經(jīng)多聚甲醛固定后進行常規(guī)石蠟切片。將EGFP基因中454 bp片段用地高辛進行標記，作為探針，對卵巢的石蠟切片進行原位雜交。結果顯示，注射質(zhì)粒24 hr后，卵巢切片

2、中的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡中都可見陽性信號，表明質(zhì)粒plRES-EGFP已經(jīng)進入卵巢的上述各種細胞中。 實驗組小鼠進行卵巢內(nèi)直接注射質(zhì)粒DNA后，進行超排并收集受精卵，在體外進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)育到桑椹胚的胚胎，部分胚胎中可見較強的綠色熒光，發(fā)綠色熒光的胚胎的比率為68/92(74.1％)，這表明EGFP基因整合到小鼠的受精卵中且能夠表達。 隨機挑取性成熟的昆明白小鼠6只，進

3、行卵巢內(nèi)直接注射質(zhì)粒plRES-EGFP，術后恢復48hr與同系的昆明白雄鼠交配，共獲得了F1代小鼠171只，其中PCR檢測為陽性的有111只，轉基因陽性率為64.91％(111/171)，PCR產(chǎn)物測序結果與已知的EGFP基因的序列同源性為100％。另外，對EGFP在F1代小鼠中的表達進行檢測，通過RT-PCR證實F1代小鼠的腎臟和肌肉中有EGFP基因的表達；隨機挑取10只轉基因F1代小鼠，分別收集其血液，經(jīng)過洗滌及固定后用流式細胞儀

4、進行EGFP表達的分析。結果發(fā)現(xiàn)6只轉基因小鼠的血液中有EGFP的表達，其表達量在11％-80％。這說明利用卵巢內(nèi)直接注射法注射質(zhì)粒后，外源基因較高效率地整合到卵母細胞中，經(jīng)受精后發(fā)育為轉基因小鼠。 收集F1代轉基因小鼠的卵巢、睪丸組織，甲醛固定后進行常規(guī)石蠟切片。原位雜交后發(fā)現(xiàn)兩種組織中均有大量的陽性信號，說明F1代小鼠的卵巢和精巢中整合有EGFP基岡，為其遺傳到一代提供了直接證據(jù)。在此期間，將性成熟的F1代轉基岡雄鼠和雌鼠

5、合籠，目前共得到F2代小鼠121只，其中PCR檢測為陽性的有81只，陽性率為66.94％(8l/21)，進一步證實通過卵巢注射法獲得的轉基因小鼠具有可遺傳性。 利用FISH技術對外源基因在F1代染色體中的整合位點進行了定位。在35只待檢測鼠中，21只鼠的染色體分裂相雜交后能夠觀察到陽性信號，檢出率為60％，并且發(fā)現(xiàn)整合發(fā)生在不同染色體上的不同位點，雜交結果中單一陽性信號與多個陽性信號的比率為3：18，這在染色體水平上證實了外源

6、基因的插入，并且證明其整合是隨機的。 根據(jù)小鼠基因組中的B1重復序列保守和EGFP基因的PolyA序列設計一對引物，對轉基因陽性小鼠的基因組進行進一步的PCR檢測，測序結果與gene bank中小鼠基因組序列比對，結果證明，外源基因整合在小鼠的1號染色體上lA3區(qū)，190，470K-190，480K之間。 本文在組織、細胞和分子水平上證實了將外源質(zhì)粒DNA注射到性成熟小鼠的卵巢中，卵巢問質(zhì)和各級卵母細胞能夠吸收、整合