小鼠鞘內(nèi)注射rAAV9載體介導跨區(qū)神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛轉(zhuǎn)基因表達.pdf

1、目的:通過導入治療性基因來治療人類疾病的思想始于二十世紀七十年代，隨后發(fā)現(xiàn)病毒可作為基因治療的載體。理想的病毒載體必須具備三個特性:一是對目標組織的高親和性和高轉(zhuǎn)導效率及對非目標細胞、組織和器官的低轉(zhuǎn)導效率。二是該病毒載體可以在一段時間內(nèi)以持續(xù)的、具治療作用的水平表達。第三也是最重要的，就是病毒載體相關(guān)的副作用如致病性及機體免疫反應最小。
　　腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)是依賴病毒屬細小病毒科

2、的一種。細小病毒屬是一種非自主性病毒，需要與其他病毒共同感染以使其表達，并且無致病性，它的這些生物特性大大降低了AAV作為基因治療載體的副作用。重組腺相關(guān)病毒(recombinant AAV, rAAV)因其安全性好、宿主細胞范圍廣、免疫源性低，在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，目前已廣泛應用于基礎(chǔ)及臨床研究。rAAV能介導目的基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的表

3、達。rAAV9為rAAV家族中的一員，有研究證實rAAV9能透過血腦屏障，并在腦和脊髓內(nèi)長時間表達目的基因，故在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中rAAV9的優(yōu)勢明顯。
　　基因治療的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)基因要被輸送到足夠數(shù)量的疾病受累細胞中。不同的注射方式所引起的轉(zhuǎn)基因表達的分布及所需病毒量不同。實質(zhì)內(nèi)注射可轉(zhuǎn)導注射局部，但對于病變范圍累及脊髓全長、腦干及皮層的肌萎縮側(cè)索硬化并不適用。靜脈內(nèi)注射rAAV9雖可轉(zhuǎn)導新生小鼠CNS的廣泛區(qū)域，但對成年

4、小鼠CNS轉(zhuǎn)導效率較低，且存在靶向性不強、載體需求量大及潛在的安全性問題。腦脊液內(nèi)注射rAAV載體沒有血腦屏障的阻礙，直接與CNS接觸。主要途徑包括腦室內(nèi)注射、小腦延髓池注射和鞘內(nèi)注射，其中鞘內(nèi)注射對脊髓的轉(zhuǎn)導更具優(yōu)勢，是沒有創(chuàng)傷的基因治療給藥方法。有研究者應用小鼠鞘內(nèi)置管注射或直接腰椎穿刺的方法研究了rAAV載體介導的轉(zhuǎn)基因表達，但存在的共同問題是不同個體間轉(zhuǎn)導程度和范圍變異較大，作者認為與操作者置管及注射成功與否的不確定性有關(guān)。直接

5、腰穿鞘內(nèi)注射相對于鞘內(nèi)置管更安全、無創(chuàng)且簡便可行，但同時存在小動物固有的技術(shù)難度。操作者直接鞘內(nèi)注射的成功程度不同將導致個體間轉(zhuǎn)導效率及臨床效果的巨大差異。因此，需要一種無創(chuàng)、簡單、可控性強的廣泛CNS轉(zhuǎn)導方法。
　　本實驗針對小鼠腰椎穿刺鞘內(nèi)注射的盲目性，建立了對鞘內(nèi)注射效果的簡單、有效的即時評估系統(tǒng)。利用改良的小鼠直接鞘內(nèi)注射法將rAAV9-CB6-EGFP注射入椎大池部位的腦脊液(cerebrospinal fluid，CS

6、F)中，研究rAAV9載體介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導范圍、效率及細胞類型。
　　方法:
　　1小鼠鞘內(nèi)注射法
　　雄性8-10周齡FVB小鼠18只，分為對照組6只及實驗組12只。小鼠清醒狀態(tài)下分別腰椎穿刺法注射PBS或rAAV9-CB6-EGFP載體(4×1010GC)8ul（含1％利多卡因），記錄注射后小鼠四肢無力及癱瘓情況，三周后新鮮或4％多聚甲醛灌流固定取材。
　　2免疫組織化學法
　　4％多聚甲醛固定的

7、腦和脊髓組織經(jīng)振動切片機切成厚20μm切片，0.01M PBS溶液漂洗;3％H2O2浸泡，封閉組織內(nèi)源性過氧化物酶;0.3％tritonX-100穿孔;10％馬血清室溫封閉，分別加入抗GFP、抗GFAP及抗Iba1抗體，二抗、辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素依次孵育后，DAB染色，撈片，脫水，透明及封片。Olympus BX51顯微鏡觀察及照相。
　　3免疫熒光法
　　4％多聚甲醛固定的脊髓組織經(jīng)30％蔗糖/PBS溶液浸泡過夜

8、至組織沉底。冷凍環(huán)境下使用包埋劑OCT包埋組織，用冰凍切片機切成厚20μm切片，經(jīng)漂洗、穿孔、封閉、一抗(anti-GFP，anti-NeuN，anti-GFAP，anti-Iba1和anti-APC)、熒光二抗孵育并再次PBS漂洗后，抗熒光衰減封片劑封片，Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察及照相。
　　4蛋白免疫印跡
　　小鼠經(jīng)麻醉后，新鮮取腰髓、頸髓、腦干、小腦、海馬、皮層和嗅球，液氮速凍后，-80℃保存待

9、用。提取組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度。蛋白上樣30ug，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫脫脂奶粉封閉后，分別加一抗4℃搖床過夜。次日，加入熒光二抗，洗膜，Odyssey紅外掃描成像系統(tǒng)掃膜并分析結(jié)果。
　　5統(tǒng)計分析
　　計量資料用(x)±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。不同部位表達水平的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1根據(jù)

10、小鼠鞘內(nèi)注射后短暫肌無力表現(xiàn)分為5級:1分，雙后肢輕度無力。2分，雙后肢中度無力，伴步態(tài)異常。3分，雙后肢癱瘓。4分，雙后肢癱瘓伴雙前肢無力。5分，四肢癱瘓伴呼吸受抑。評分4-5分為注射成功。18只注射的小鼠中有14只注射成功，成功率為77.8％。
　　2鞘內(nèi)注射PBS組小鼠脊髓GFP免疫組織化學染色呈陰性，rAAV9載體注射組小鼠脊髓GFP免疫組化染色呈不同程度陽性，與注射后短暫肌無力評分呈明顯正相關(guān)。成功注射的小鼠脊髓GFP表

11、達明顯強于注射失敗小鼠，岡此通過注射后肌無力表現(xiàn)能預測中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導效果。
　　3小鼠鞘內(nèi)注射rAAV9載體后，脊髓全長均有轉(zhuǎn)基因表達，以前角、后角、前根發(fā)出區(qū)及后根傳入?yún)^(qū)域為著。腦干、小腦及前腦均可見不同程度、散在的轉(zhuǎn)基因表達。GFP陽性細胞以膠質(zhì)細胞為主，可見脊髓前角神經(jīng)元、小腦蒲肯野細胞、皮層及海馬神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因表達。
　　4免疫熒光顯示神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞均存在GFP表達。
　　5免

12、疫印跡顯示GFP在腰髓表達最高，其次是頸髓、嗅球、海馬和皮質(zhì)，腦干和小腦轉(zhuǎn)基因表達較低。
　　6成功轉(zhuǎn)導rAAV9載體的小鼠腰髓未見明顯小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞增生，與對照組相比無明顯差異。
　　結(jié)論:小鼠鞘內(nèi)注射rAAV載體簡便、無創(chuàng)，通過加入利多卡因可有效地預測中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導效率;rAAV9載體經(jīng)腰椎穿刺注入CSF后，在脊髓全長及腦組織內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達范圍廣泛，且不引起明顯的神經(jīng)炎性反應，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中具