精子載體法制備轉(zhuǎn)基因豬的初步研究.pdf

1、精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是以精子為載體，在受精時將外源目的基因?qū)肼涯讣毎?，是目前轉(zhuǎn)基因動物研究中簡單而高效的方法學(xué)之一。本試驗主要研究了在豬精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移過程中精子與外源結(jié)合的影響因素，并對利用精子載體法制備轉(zhuǎn)基因豬胚胎進行了初步研究，為利用精予介導(dǎo)法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬和其它轉(zhuǎn)基因哺乳動物提供了技術(shù)參考。
　　 本試驗進行了如下研究
　　 一、豬精子結(jié)合和內(nèi)化外源基因的影響因素研究:精子結(jié)合和內(nèi)化外源基因的效率是精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因成功

2、的關(guān)鍵。本試驗以DIG標記的線性化EGFP作為示蹤基因來檢測豬精子結(jié)合和內(nèi)化外源基因的影響因素，結(jié)果表明:豬精子能夠自發(fā)結(jié)合外源基因，結(jié)合部位主要在精子頂體后區(qū)。精子結(jié)合外源DNA的陽性率隨共孵育時間延長而增加，在37℃或39℃時孵育60分鐘后，陽性率不再增加;在17℃時孵育90分鐘后，陽性率不再增加。在檢查的15只公豬樣本中，精子與外源DNA的結(jié)合率為6.57％-35.81％，內(nèi)化率為2.99％-24.66％，個體間差異顯著(p＜0.

3、01)。精漿能夠強烈抑制外源基因的結(jié)合和內(nèi)化，脂質(zhì)體及DMSO能夠顯著提高轉(zhuǎn)染效率。死精子能夠結(jié)合外源基因，但不能將其內(nèi)化;反復(fù)凍融導(dǎo)致質(zhì)膜破裂的精子對外源基因有更高的結(jié)合率，且不受個體影響。
　　 二、豬體外受精的研究:探討豬胚胎體外生產(chǎn)過程中各環(huán)節(jié)的相關(guān)影響因素，以期建立起一套行之有效的豬胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)，為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬胚胎提供技術(shù)支持。結(jié)果表明:抽吸法從每只卵巢平均采得卵母細胞個數(shù)顯著低于切割法和破碎法，但所得可用卵母細胞

4、率、成熟率均顯著高于另兩種方法;中等大小卵泡卵母細胞成熟率最高，小卵泡的成熟率顯著低于大、中卵泡;豬卵母細胞體外成熟最佳培養(yǎng)溫度為39℃;20IU/mlPMSG+10IU/mlhCG的激素組合最有利于豬卵母細胞的體外成熟;獲能液中單獨添加肝素不能使豬卵母細胞受精，聯(lián)合使用咖啡因和肝素可以提高受精率;TCM199不支持胚胎越過4-細胞發(fā)育阻斷，NCSU-23添加BSA的培養(yǎng)效果優(yōu)于添加FCS。
　　 三、利用精子載體法體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)基