利用精子載體法制備LTF轉基因山羊的初步研究.pdf

1、精子介導基因轉移是以精子為載體，在受精時將外源目的基因導入卵母細胞，是目前轉基因動物研究中簡單而高效的方法學之一。乳鐵蛋白(LTF)也稱為乳轉鐵蛋白,是一種鐵結合蛋白，廣泛分布于多種組織、細胞內，具有非特異性免疫、參與鐵代謝和細胞生長調節(jié)等功能。研究了在精子介導基因轉移過程中精子與外源結合的影響因素，并對利用精子載體法制備LTF轉基因山羊進行了初步研究。 精子與外源DNA共孵育后，精子結合外源DNA的效率就成為精子介導轉基因法成

2、功的關鍵。以DIG標記的EGFP作為示蹤基因來檢測精子結合外源DNA的影響因素，用考馬斯亮藍染色技術評價精子的頂體反應。結果顯示：山羊精子能夠自發(fā)的結合外源DNA，而且，最初的結合部位在精子外膜的頂體后區(qū)，在檢查的27只公羊樣本中，結合率在3.2％-48.40％，不同供體的精子結合外源DNA的能力有顯著差異(p<0.01)。同一山羊的精子分別在17℃、27℃、37℃條件下，與外源DNA共孵育。結果表明：精子與外源DNA的結合率隨共孵育時

3、間的延長而增加。在27℃和37℃下，孵育60分鐘后的結合率不再增加，同樣的結果出現(xiàn)在17℃處理了90分鐘的試驗組里。為獲得高轉染率，分別對EGF、Insulin,肝素和ITS四種因子對精子結合外源DNA的影響也進行了評價。結果表明：用添加10 ng/ml EGF的BO液能顯著提高轉染率(試驗組30.5％，對照組19.4％)，但精子獲能的比率變化不大。相似的結果出現(xiàn)在Insulin和肝素處理的組里。用ITS的最終濃度(0.5％-5％)評價

4、其促進DNA與精子的結合能力。在0.5％ITS組，試驗組(0.5％，16.2％；1％，12.0％；2％，9.5％；5％，9.4％)和對照組(21.9％)外源DNA的轉染率顯著不同。精子獲能率在5％ITS試驗組和對照組差異顯著(64.7％vs.86.2％)，但其他試驗組差異不顯著(0.5％，87.9％；1％，85.7％；2％，82.7％)。此外，EGF(10 ng/ml)、Insulin(5 ug/ml)和肝素(10 ug/ml)對DNA

5、轉染的比率也進行了評價，試驗組和對照組有明顯差異(27.9％VS.19.3％)(p<0.05)。然而，BO液添加LipefectaminTM-2000抑制三個因子對山羊精子轉染外源DNA的促進作用(22.1％VS.27.9％)(p<0.05)。對70只母羊進行同期發(fā)情處理，其中有26只發(fā)情，發(fā)情率為37.1％。精子與LTF基因共孵育后，對62只母羊進行人工授精，共產生后代26只，經過PCR檢測LTF陽性后代有2只，陽性率為7.7％，試驗