轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

1、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù) ---轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建,2,,基因打靶的簡(jiǎn)易程序,3,優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體,胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法,2024/3/5,4,2024/3/5,5,主要是利用反轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)

2、序列(LTR)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的特點(diǎn),將外源基因連接到LTR下游進(jìn)行基因重組后,再包裝成為高滴度病毒顆粒,去直接感染受精卵或顯微注入囊胚腔中,攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。,3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法,6,3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法,優(yōu)點(diǎn)由于反轉(zhuǎn)錄病毒的高效率感染和在宿主細(xì)胞DNA中的高度整合特性, 大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運(yùn)載至細(xì)菌中擴(kuò)增和表達(dá)。病毒載體是較理想的真核基因工程載體

3、缺點(diǎn)獲得純合體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的機(jī)會(huì)少病毒載體構(gòu)建復(fù)雜轉(zhuǎn)入的外源基因的大小受到限制, <10kb轉(zhuǎn)入病毒自身基因的復(fù)制表達(dá),2024/3/5,7,4、體細(xì)胞核移植法,首先將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到體外培育的動(dòng)物體細(xì)胞中,篩選出陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并進(jìn)行繁殖,制備出供移植用的細(xì)胞核供體。然后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核供體移植到去核的卵母細(xì)胞中,重構(gòu)胚胎經(jīng)過激活和培養(yǎng)后,移植到代孕小鼠中1997 年, 英國Roslin 研究所的Wilmut等利用成年綿羊

4、乳腺上皮細(xì)胞作為核供體,成功獲得了體細(xì)胞克隆綿羊多莉(Dolly) ,拉開了動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的序幕。,2024/3/5,8,顯微法和克隆法效率比較,1997 Nature 385, 810–813,4、體細(xì)胞核移植法,2024/3/5,9,優(yōu)點(diǎn)減少受體動(dòng)物的數(shù)目,不需要用受體母畜來承擔(dān)那些非轉(zhuǎn)基因的胚胎,表現(xiàn)了強(qiáng)大的生命力。事先在細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選,簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié),節(jié)約了人力,具有很大的優(yōu)越性。

5、缺點(diǎn)體細(xì)胞克隆技術(shù)近年來發(fā)展勢(shì)頭十分迅猛,但在基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上還需進(jìn)一步探索。,4、體細(xì)胞核移植法,2024/3/5,10,5、精子載體法,將精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后,使精子有能力攜帶外源基因進(jìn)入卵中,受精后進(jìn)行胚胎移植,這樣產(chǎn)生的動(dòng)物也會(huì)使外源基因得到表達(dá)。精子攜帶DNA的途徑外源DNA與精子共孵育電穿孔導(dǎo)入法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,2024/3/5,11,優(yōu)點(diǎn)基因轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)便,效率高動(dòng)物育種不經(jīng)過嵌合體,實(shí)驗(yàn)

6、周期短缺點(diǎn)目的基因整合的隨機(jī)性無法早期驗(yàn)證修飾事件成功率不高、效果不穩(wěn)定,5、精子載體法,2024/3/5,12,6、YAC法（人工酵母染色體法）,優(yōu)點(diǎn)：克隆百萬堿基對(duì)(Mbp) 級(jí)的大片段外源DNA 的能力,可以保證巨大基因的完整性; 保證所有順式作用因子的完整并與結(jié)構(gòu)基因的位置關(guān)系不變;保證較長的外源基因片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中整合率的提高; 鑒于基因的完整性,目的基因上下游的側(cè)翼序列可以消除或減弱基因整合的位置效率。

7、缺點(diǎn)：不穩(wěn)定，制備工藝繁瑣。,2024/3/5,13,7、BAC法（人工細(xì)菌染色體法）,建立在大腸桿菌的F因子上的BAC載體：外源DNA可>300kb。F因子（F質(zhì)粒）是一種“性質(zhì)?！保赊D(zhuǎn)移至F-宿主細(xì)胞。100kb,近百個(gè)蛋白質(zhì)?？蓸?gòu)建BAC文庫；有單一的loxp位點(diǎn)，利于圖譜分析（借助標(biāo)記loxp和cre 重組酶； BAC載體兩端有Sp6和T7 引物序列利于測(cè)序，確定基因的 染色體定位；可穩(wěn)定遺傳，易于

8、操作。BAC文庫：基因組酶切后100～300kbDNA+BAC?大腸桿菌,2024/3/5,14,基因轉(zhuǎn)移方法的比較,2024/3/5,15,,Electroporation,2024/3/5,16,電擊儀,2024/3/5,17,2024/3/5,18,2024/3/5,19,2024/3/5,20,2024/3/5,21,2024/3/5,22,,2024/3/5,23,2024/3/5,24,2024/3/5,25,轉(zhuǎn)基因小鼠技

9、術(shù)---轉(zhuǎn)基因小鼠在科研中的應(yīng)用,2024/3/5,26,1. 7500萬－1.25億年前 -- 人鼠始祖,小鼠的歷史,2. 19世紀(jì) -- 寵物鼠---實(shí)驗(yàn)鼠的“先驅(qū)”,3. 1897年 -- 重組表型,2024/3/5,27,,4. 1900年 -- 從寵物鼠到實(shí)驗(yàn)鼠,Abbie Lathrop----飼養(yǎng)寵物鼠1902年，William Ernest Castle購買老鼠，用于遺傳學(xué)研究。哈佛大學(xué)---老鼠的毛色進(jìn)行觀察，以檢

10、測(cè)孟德爾法則的正確性。,小鼠的歷史,5. 1905年 -- 孟德爾老鼠,通過對(duì)黃白相間的雜色鼠進(jìn)行研究，法國遺傳學(xué)家Lucien Claude Cuéno 發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)攜帶黃色皮毛基因的老鼠之間交配，其子代老鼠中黃色老鼠和白色老鼠的數(shù)量比總是2:1。--這是報(bào)道的第一個(gè)等位純合致死的基因。,2024/3/5,28,Clarence Cook Little是一個(gè)來自于William Castle 實(shí)驗(yàn)室的哈佛大學(xué)生物學(xué)家，他培育出

11、了第一個(gè)近親繁殖的小鼠株系――DBA。,小鼠的歷史,6. 1909年 -- 實(shí)驗(yàn)鼠的誕生,Clarence Little 和 Ernest Tyzzer 發(fā)現(xiàn)在同一株系小鼠間進(jìn)行腫瘤移植不會(huì)產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，但不同株系間的移植則會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)。,7. 1916年 -- 腫瘤易受性和組織相容性,Jackson實(shí)驗(yàn)室的George Snell在1940年代發(fā)現(xiàn)了組織相容性基因---榮獲了1980年的諾貝爾獎(jiǎng),2024/3/5,29,8. 192

12、1年 -- C57BL株系,基因組測(cè)序在2002年完成,小鼠的歷史,9. 1929年 -- Jackson 實(shí)驗(yàn)室 ---世界上最重要的小鼠遺傳學(xué)研究中心,在Hudson 汽車公司的頭目Edsel Ford和Roscoe Jackson兩位大財(cái)主的資助下，Charence Little 在美國緬因州Bar Harbor 建立了Jackson 實(shí)驗(yàn)室,2024/3/5,30,10. 1953年 -- DNA雙螺旋,Crick，Watso

13、n和Wilkins三人因?yàn)檫@項(xiàng)杰出的成就榮獲了1962年的諾貝爾獎(jiǎng)。,11. 1966年 -- 遺傳密碼破譯,Robert Holly，Har Gobind Khorana 和 Marshall Nirenberg 破譯了遺傳密碼---1968年的諾貝爾獎(jiǎng),小鼠的歷史,2024/3/5,31,12. 1972年 --- 小鼠遺傳學(xué)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫,Jackson 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了第一個(gè)哺乳動(dòng)物遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫,13. 1977年 -- Sa

14、nger 測(cè)序法,和同事Walter Gilbert分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)---人類和小鼠基因組測(cè)序過程中的主要技術(shù),14. 1982年 -- 轉(zhuǎn)基因小鼠,,小鼠的歷史,2024/3/5,32,16. 1987-89年 -- 第一只基因敲除小鼠,Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 領(lǐng)導(dǎo)的幾個(gè)研究小組--- 2001獲得了Lasker獎(jiǎng),17. 1996年 -- “百慕大法則”

15、,公共基因組序列數(shù)據(jù),18. 1998年 -- 克隆鼠,1997年克隆羊“多莉”誕生之后，夏威夷的一個(gè)小組培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹們。,15. 1983年 -- PCR,Kary Mullis --1993年的諾貝爾獎(jiǎng),小鼠的歷史,2024/3/5,33,19. 1999年 -- 小鼠基因組測(cè)序協(xié)會(huì),人類基因組三個(gè)主要測(cè)序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute

16、, The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一個(gè)相互協(xié)作的小鼠基因組測(cè)序機(jī)構(gòu)，取名為小鼠基因組測(cè)序協(xié)會(huì)（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC),20. 2001年2月 -- 人類基因組,21. 2001年6月 -- 散彈法,美國公司Celera Ge

17、nomics 使用散彈法測(cè)得了用于銷售的小鼠序列草圖。散彈法是一種一次性測(cè)得基因組全序列的技術(shù)。,小鼠的歷史,2024/3/5,34,22. 2002年5月 -- 16號(hào)染色體與已被分析的人類 21號(hào)染色體序列高度相似,23. 2002年8月 -- 小鼠基因組物理圖譜,24. 2002年12月 -- 小鼠基因組,小鼠基因組測(cè)序協(xié)會(huì)發(fā)表了一份高質(zhì)量的小鼠基因組序列草圖，并且同時(shí)對(duì)C57BL/6J小鼠株系做了分

18、析。這個(gè)基因組大小約為2.5Gb，比人類基因組要小，預(yù)計(jì)的基因也少于30000個(gè)。約有40%的小鼠和人類基因組序列相高度似性，80%的人類基因在小鼠基因組中能找到相應(yīng)的基因。同時(shí)還有不少文章對(duì)小鼠遺傳組成的其它方面做了詳細(xì)討論。在日本RIKEN 基因組科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的努力下，很多相關(guān)的重要資源都能夠被免費(fèi)獲取。,小鼠的歷史,2024/3/5,35,轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的應(yīng)用,基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因工程定向育種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

19、生物反應(yīng)器研制 人類疾病小鼠模型與基因治療藥理學(xué)研究器官移植環(huán)境科學(xué)研究,2024/3/5,36,基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究,Hox gene(同源異形盒基因）疾病基因?qū)W習(xí)與記憶基因生理周期基因,基因表達(dá)有時(shí)空與組織的特異性；外源基因的表達(dá)受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；,2024/3/5,37,基因工程定向育種,向動(dòng)物體轉(zhuǎn)移外源基因并使之在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，能夠克服物種間固有的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物育種之間遺傳

20、物質(zhì)的交換。實(shí)質(zhì)是將基因轉(zhuǎn)移與傳統(tǒng)育種方法結(jié)合，各取其精華，快速創(chuàng)造新的目的變異和固定擴(kuò)展變異，從而快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆動(dòng)物品種。轉(zhuǎn)基因羊、豬、雞、魚、鼠等,2024/3/5,38,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器概念： 將具某種重要應(yīng)用價(jià)值的生物活性蛋白基因?qū)雱?dòng)物受精卵或早期胚胎，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使外源基因在動(dòng)物的特定組織內(nèi)高效表達(dá)，再從這些組織的分泌液、浸出液或血清中分離提取目的基因產(chǎn)物。乳腺---理

21、想器官 腎臟和膀胱多肽藥物、蛋白質(zhì)疫苗、酶類,細(xì)菌-動(dòng)物細(xì)胞-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,2024/3/5,39,乳腺生物反應(yīng)器具有以下特點(diǎn)：⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達(dá)的蛋白質(zhì)不回流到血液循 環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物本身的影響；⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器；一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。

22、⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達(dá)的蛋 白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性 接近天然產(chǎn)品；⑷在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖 生產(chǎn)群體。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制,2024/3/5,40,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制,乳腺組織特異表的基因：具milk box保守序列 ----乳清蛋白基因----b乳球蛋白基因----酪蛋白基因已開發(fā)的產(chǎn)物：----

23、血栓治療藥物（組織型纖溶酶原激活因子) ----出血性疾?。蜃覸III，IX）----免疫治療藥物（IFN，IL，TNF）----營養(yǎng)制劑(人乳鐵蛋白）,2024/3/5,41,人類疾病小鼠模型與基因治療,癌癥---肺癌---p53功能缺陷遺傳病---地中海貧血（臨床失敗---細(xì)胞表達(dá)？）AD ---對(duì)AD患者死亡后腦部解剖發(fā)現(xiàn)腦部存積了一種β淀粉狀蛋白 ----將人類β淀粉狀蛋白的基因轉(zhuǎn)

24、到大鼠體內(nèi)使其發(fā)病， 再清除β淀粉狀蛋白，發(fā)現(xiàn)能夠減慢甚至停止病情,,2024/3/5,42,藥理學(xué)研究,胰島b細(xì)胞B7-1轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)STZ敏感阿霉素抗癌，但心臟毒性等副作用大---金屬硫蛋白MT具保護(hù)作用P糖蛋白---腫瘤多藥耐藥---knockout mice證實(shí)其影響藥物的分布與清除,2024/3/5,43,器官移植,超急性排斥反應(yīng)補(bǔ)體激活的阻斷---免疫抑制劑危險(xiǎn)補(bǔ)體活性調(diào)節(jié)因子的負(fù)

25、調(diào)控---膜輔助因子MCP---衰退促進(jìn)因子hDAP/hCD591999---豬心—獼猴（器官大?。?2024/3/5,44,環(huán)境科學(xué)研究,生物可利用性的分析只能在活體研究毒理/環(huán)境基因組學(xué)轉(zhuǎn)基因線蟲---HSP16/lacZ,45,轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的主要問題,外源基因的整合率低外源基因的表達(dá)不理想成本高轉(zhuǎn)基因給動(dòng)物造成插入突變和機(jī)能紊亂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成活率低轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品的安全性,改善外源基因轉(zhuǎn)移方法定點(diǎn)整合-