以原核顯微注射技術(shù)建立Csnk1ε轉(zhuǎn)基因小鼠及其表達(dá)檢測.pdf

1、酪蛋白激酶1(Casein Kinase1，Csnk1)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，已經(jīng)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)并得到了7個Csnk1的同工酶，分別是Csnk1a、Csnk1b、Csnk1g1、Csnk1 g2、Csnk1g3、Csnk1d和Csnk1ε。相關(guān)研究表明，Csnk1ε的堿基缺失或突變可能對毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長具有一定影響。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種來源于細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。為深入研究Csn

2、k1ε對毛囊的作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)使得Csnk1ε定點(diǎn)整合于小鼠Rosa26位點(diǎn)上，再通過原核顯微注射技術(shù)技術(shù)，制備Csnk1ε轉(zhuǎn)基因小鼠。通過PCR及Southern Blot檢測方法鑒定陽性小鼠，并通過Real-time PCR，Western Blot方法對轉(zhuǎn)基因陽性小鼠進(jìn)行表達(dá)檢測。
　　1、sgRNA載體及打靶載體構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)通過麻省理工學(xué)院的CRISPR Design軟件設(shè)計(jì)5對s

3、gRNA，以sgRNA-T2為模板，擴(kuò)增得到相應(yīng)的U6啟動子和sgRNA骨架載體，最終構(gòu)建得到完整的sgRNA載體。打靶載體的構(gòu)建是以人源K14啟動子，即皮膚特異性啟動子啟動目的基因，經(jīng)測序得知其同源性為98％。為了確保該啟動子的啟動功能，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了以該啟動子啟動的紅色熒光蛋白表達(dá)載體pK14-DsRed，用以下一步細(xì)胞水平檢測。再利用同源重組技術(shù)原理在已經(jīng)確定的靶位點(diǎn)，即小鼠Rosa26第一內(nèi)含子處，分別向上、下各取1kb左右作為打

4、靶載體的上、下游同源臂，最終將打靶載體構(gòu)建成功。
　　2、細(xì)胞水平的相關(guān)檢測
　　本研究主要利用電穿孔轉(zhuǎn)染法將紅色熒光蛋白表達(dá)載體pCMV-DsRed導(dǎo)入MEF中，篩選出適應(yīng)于MEF的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件，即160V/5Ms。利用該轉(zhuǎn)染條件將Cas9載體和sgRNA載體共同轉(zhuǎn)染于MEF中，培養(yǎng)48h后提取基因組，通過設(shè)計(jì)跨靶位點(diǎn)的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雜交后再通過Surveyor突變檢測試劑盒進(jìn)行鑒定，從而確定sgRN

5、A敲除位點(diǎn)為Rosa26基因的第一內(nèi)含子的第1096bp處，其敲除效率為36.52％。同理，將構(gòu)建好的人源K14啟動子啟動的紅色熒光蛋白表達(dá)載體pK14-DsRed，導(dǎo)入MEF中，通過觀察紅熒光的表達(dá)情況可知該啟動子具有啟動功能，可用于下一步實(shí)驗(yàn)中。最后將hCas9載體、sgRNA載體及打靶載體共轉(zhuǎn)染于MEF中，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明具備同源重組條件，可用于下一步轉(zhuǎn)基因打靶小鼠的建立，同時該檢測引物可用于轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的檢測。

6、　　3、Csnk1ε轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及鑒定
　　本研究將構(gòu)建好的Csnk1ε打靶載體，根據(jù)同源重組技術(shù)原理，利用原核顯微注射法制備小鼠18只，通過PCR及Southern Blot鑒定后得到Csnk1ε隨機(jī)整合陽性小鼠1只，并未得到Csnk1ε定點(diǎn)整合的陽性小鼠。隨機(jī)整合陽性小鼠通過傳代得到F1代陽性小鼠1只，說明該轉(zhuǎn)基因陽性小鼠能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定遺傳給予代。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出Csnk1ε轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為以后研究該基因的功能創(chuàng)造了

7、實(shí)驗(yàn)條件。
　　4、Csnk1ε轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)水平的檢測
　　本實(shí)驗(yàn)首先對轉(zhuǎn)基因陽性小鼠進(jìn)行了mRNA水平的檢測，以GAPDH為內(nèi)參基因，通過Real-time PCR檢測結(jié)果為:轉(zhuǎn)基因陽性小鼠Csnk1εmRNA表達(dá)量是同窩對照小鼠的2.65倍。然后對其進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的檢測，以α-tubulin為內(nèi)參基因，通過Western Blot檢測結(jié)果是同窩對照小鼠的1.243倍。通過上述檢測手段，說明目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入小鼠的基因