水稻OsCIPK基因家族的克隆與轉OsCBL8基因水稻的抗逆性分析.pdf

1、在植物細胞的逆境信號轉導途徑中，Ca2+作為第二信使具有非常重要的作用。當植物細胞受到脅迫刺激時，會產(chǎn)生具有時空特征的Ca2+信號，通過各種Ca2+傳感器蛋白識別和解碼，激活下游的級聯(lián)應答反應，導致許多逆境相關基因被誘導表達。類鈣調磷酸酶B亞基蛋白(CBL)家族是植物中特有的一類鈣結合蛋白，CBL互作蛋白激酶(CIPK)家族是一類依賴Ca2+的絲氨/酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有保守的類SNF激酶結構域和NAF基序。CBL/CIPK信號系統(tǒng)被

2、認為在植物逆境應答的信號轉導中具有重要作用。水稻(Oryza sativa L.)是單子葉植物中研究最廣泛的模式植物，也是世界上最重要的糧食作物，開展水稻CBL及CIKP基因的研究，不僅有助于了解植物逆境脅迫下CBL/CIPK信號網(wǎng)絡的機制，而且對水稻及其它作物的抗逆性遺傳改良也具有重要的指導作用。 本研究根據(jù)擬南芥AtCIPK基因家族的氨基酸序列，利用電子克隆的方法，從水稻中分離了12條編碼CIPK基因的全長cDNA序列，比較

3、其基因組結構，發(fā)現(xiàn)12個基因的內含子、外顯子結構差異較大，其中OsCIPK3和OsCIPK24基因還存在兩種不同的可變剪接方式；氨基酸序列分析表明12個OsCIPK蛋白的序列同源性較高，氨基酸一致性在41.2～78.5％之間，所有OsCIPKs蛋白的N端都具有一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域，C端都合有與CBL蛋白互作必需的NAF基序，對水稻幼苗中OsCIPKs基因的表達特征及多種逆境處理下的誘導表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)高鹽、低鉀、ABA、

4、汞脅迫、低溫和白葉枯病菌等處理條件下，不同OsCIPK的表達特征明顯不同，其中OsCIPK2、10、11和14基因等4個基因在上述6種逆境處理下的表達量都明顯增加，推測這4個基因可能是逆境應答途徑的上游調控因子，參與了多個抗逆信號轉導途徑。擬南芥AtCIPK24/SOS2已經(jīng)被證明是耐鹽SOS途徑中的關鍵因子，本研究為了證實水稻OsCIPK24在逆境中的功能，將該基因兩種可變剪接的ORF分別連接到pCAMBIA1304中，構建了兩個過量

5、表達的雙元載體，利用農(nóng)桿菌介導法轉化水稻日本晴愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測，獲得了抗性轉基因水稻幼苗。目前，OsCIPK24轉基因植株的培育和功能檢測正在進行之中。 對前期利用農(nóng)桿菌介導法獲得的OsCBL8過量表達和抑制表達的轉基因株系(T3代)進行目標基因的表達特征測定、農(nóng)藝性狀考察和高鹽、干旱和低溫等非生物逆境的耐逆性鑒定。半定量RT-PCR結果表明，轉正義基因顯著增強了植株中OsCBL8基因的表達量，而轉反義基因則對

6、內源OsCBL8基因的表達具有一定的抑制作用；在田間生長條件下，16個轉基因株系的株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、穗長、百粒重等與對照無顯著差異，但每穗實粒數(shù)和結實率顯著或極顯著低于對照，其中5個轉基因株系的每穗實粒數(shù)和結實率極顯著低于對照。獲得一個耐鹽性增強的轉正義基因株系8F12，在150 mM NaCl處理10 d后，其幼苗根系K+/ Na+比顯著高于轉反義基因株系和對照，莖葉K+/ Na+比與轉反義基因株系和對照無顯著差異；篩選獲得一個