DEL1調(diào)控?cái)M南芥階段轉(zhuǎn)變生長發(fā)育的分子機(jī)制研究.pdf

1、植物階段轉(zhuǎn)變是指植物由一個(gè)生長發(fā)育階段進(jìn)入下一個(gè)生長發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變過程。植物階段轉(zhuǎn)變過程分為兩個(gè)部分，一是營養(yǎng)生長階段幼年期轉(zhuǎn)變?yōu)槌赡昶诘倪^程，該階段轉(zhuǎn)變發(fā)育過程可與植物生物量、產(chǎn)量、株型、抗逆性及次生代謝物合成密切相關(guān);二是營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L期的過程，標(biāo)志特征為抽薹開花。研究表明miR156-SPLs途徑是調(diào)控植物營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)變的主調(diào)控途徑，同時(shí)也是植物生殖生長階段轉(zhuǎn)變重要的年齡調(diào)控途徑，因此，開展miR156-SPLs途徑上

2、下游基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究，不僅可以揭示植物階段轉(zhuǎn)變發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，而且可為今后作物高產(chǎn)、理想株型、抗性等育種實(shí)踐提供理論參考。
　　本項(xiàng)目通過正向遺傳學(xué)的方法，利用EMS誘變擬南芥，于M2群體中篩選獲得一份階段轉(zhuǎn)變延遲突變體（Phase transition delay mutant1，命名為del1），經(jīng)圖位克隆、候選基因測序、等位互補(bǔ)測定分析確定del1為FRY1（也稱SAL1）基因的一份功能缺失等位突變體。FRY1編碼的蛋白

3、具有多磷酸肌醇1-磷酸酶(inositol polyphosphate1-phosphatase)和3'，(2')，5'-二磷酸核苷酸磷酸酶(3'(2')，5'-bisphosphate nucleotidephosphatase)的雙重功能，F(xiàn)RY1功能缺失突變體具有多樣性缺陷表型，比如干旱抗性、葉片形態(tài)、根形態(tài)等，但是，該基因與植物階段轉(zhuǎn)變之間的關(guān)系尚未見研究報(bào)道。
　　本研究以del1突變體為研究對(duì)象，通過圖位克隆分析、候選

4、基因測序分析、等位互補(bǔ)測定分析、階段轉(zhuǎn)變表型觀察、階段轉(zhuǎn)變相關(guān)途徑基因表達(dá)檢測、基因間遺傳關(guān)系分析、抗旱生理指標(biāo)測定等研究，獲得如下研究結(jié)果:
　　1、圖位克隆分析確定del1突變體的突變位點(diǎn)位于5號(hào)染色體MGI19和MSJ1標(biāo)記引物之間，物理距離為157 kb。
　　2、候選區(qū)間內(nèi)基因功能分析推測del1突變體突變基因?yàn)锳T5g63980(FRY1或SAL1)，基因克隆測序發(fā)現(xiàn)del1突變體中AT5g63980基因的第五內(nèi)

5、含子末位G堿基突變?yōu)锳，即GT-AG突變?yōu)镚T-AA;提取del1突變體mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，克隆測序發(fā)現(xiàn)上述內(nèi)含子邊界的突變（GT-AG突變?yōu)镚T-AA），使得del1突變體中AT5g63980基因的第五內(nèi)含子選擇性剪切位置移至下一個(gè)AG位點(diǎn)，造成第五內(nèi)含子較WT長16 bp，相對(duì)應(yīng)的,del1突變體中AT5g63980基因的成熟mRNA序列缺失16 bp;編碼蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，mRNA序列中16 bp堿基缺失造成移碼和翻譯

6、提前終止，DEL1蛋白的C末端功能域缺失。
　　3、于TAIR購買AT5g63980基因的T-DNA插入功能缺失突變體SALK_020882，與del1雜交獲取F1。WT、SALK_020882、del1、 F1表型觀察發(fā)現(xiàn)，SALK_020882、del1、 F1具有一致的缺陷表型，上述等位互補(bǔ)測定結(jié)果確定del1為AT5g63980基因的一份功能缺失等位突變體。
　　4、階段轉(zhuǎn)變相關(guān)表型觀察發(fā)現(xiàn):相比較WT，del1突變

7、體葉片更圓，相同葉位的葉片長寬比都要比WT小，葉片發(fā)生速率相同時(shí)間要比野生型慢1片左右，葉片下表皮毛發(fā)生葉位要比野生型遲1.98片，蓮座葉數(shù)目比野生型多4.41片，抽薹開花延遲11.78天，體現(xiàn)為營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)變和生殖生長階段轉(zhuǎn)變延遲表型。
　　5、基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示，del1突變體中，miR156及其靶基因SPL9表達(dá)量與WT無顯著變化，SPL3則顯著下調(diào);此外，pri-MIR172B及miR172在del1突變體中表達(dá)水平都

8、要比野生型低;開花相關(guān)的基因檢測顯示FUL、LFY、AP1、SOC1在del1突變體中被抑制。利用實(shí)驗(yàn)室已有的pSPL3∷rSPL3-G US報(bào)告株系，雜交獲取pSPL3∷rSPL3-GUS/del1材料，GUS染色發(fā)現(xiàn)，del1突變體背景下，rSPL3-GUS著色能力減弱，該結(jié)果與基因表達(dá)檢測顯示SPL3在del1突變體中顯著下調(diào)相吻合。
　　6、基于基因表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)del1突變體中miR172及SPL3表達(dá)水平受到抑制，遺傳關(guān)

9、系分析結(jié)果顯示，miR172過表達(dá)(Ubi1∷MIR172B)及SPL3過表達(dá)(35S∷rSPL3)能夠回復(fù)del1階段轉(zhuǎn)變延遲表型，表明DEL1作用于miR172及SPL3上游。
　　7、抗逆生理檢測研究發(fā)現(xiàn):干旱處理過程中，del1突變體的失水率在0到300 min內(nèi)的11個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均顯著低于WT的失水率，干旱處理后的存活率比野生型高10％;1/2MS培養(yǎng)基添加甘露醇模擬抗旱實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，del1突變體相對(duì)根長在不同甘露醇條件下都

10、比野生型要長。上述生理指標(biāo)測定結(jié)果證明del1突變體較WT抗旱能力增強(qiáng)。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DEL1（也稱為FRY1、SAL1）具有正調(diào)控?cái)M南芥階段轉(zhuǎn)變發(fā)育過程的功能。基于階段轉(zhuǎn)變已有的研究積累，以及本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出以下作用過程:DEL1通過某種未知方式正調(diào)控階段轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵miRNA-miR172，miR172通過其靶基因AP2-like基因負(fù)調(diào)控下游基因（包括SOC1、SPL3、LFY、 AP1、FUL，其中，S