煙草類胡蘿卜素雙加氧裂解酶基因的克隆與功能研究.pdf

1、類胡蘿卜素（Carotenoid）是煙草中一種重要的萜烯類化合物。新鮮煙葉中的類胡蘿卜素主要有葉黃素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和β-胡蘿卜素，它們在煙草的生長、烤制和調(diào)制過程中起著重要的作用，其含量不僅與煙葉的光澤、色澤相關(guān)，也影響著煙葉的香味品質(zhì)。類胡蘿卜素裂解的產(chǎn)物是煙葉致香的重要成分，包括紫羅蘭酮、大馬酮等，這些物質(zhì)香味閾值很低、刺激性小、對香味貢獻(xiàn)比較大。
　　類胡蘿卜素雙加氧裂解酶（Carotenoid cleavage diox

2、ygenases，CCDs）是一類能在不同雙鍵處裂解植物中不同類胡蘿卜素的酶，產(chǎn)物為脫輔基類胡蘿卜素。這些物質(zhì)有些參與植物的生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，如脫落酸和獨(dú)腳金內(nèi)酯；有些是花和果實(shí)顏色、風(fēng)味及香味成分，如具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的紅木素、藏紅花苷，閾值很低的香味成分β-紫羅蘭酮、香葉基丙酮等。CCDs是一個(gè)古老的基因家族，目前發(fā)現(xiàn)有九個(gè)成員，活性區(qū)域具有很強(qiáng)的保守性，其中CCD1主要作用于類胡蘿卜素的9-10/9‘-10‘、C5-C6C5‘-C6‘

3、和C7-C8C7‘-C8‘雙鍵處，分別生成C13β-ionone、C86-methyl-5-hepten-2-one和C10 geranial。
　　本文以栽培煙草品種沙姆遜（Samsun）為材料克隆NtCCD1和NtCCD4基因，并對其序列和功能進(jìn)行分析研究，結(jié)果如下：
　?。?）煙草中有兩個(gè)NtCCD1（NtCCD1A和 NtCCD1B）基因和一個(gè)NtCCD4基因。多序列比對表明NtCCD1和NtCCD4蛋白含有多個(gè)保守

4、域和實(shí)現(xiàn)功能必須的4個(gè)組氨酸，它們都是水溶性蛋白。NtCCD1催化生物反應(yīng)的場所在細(xì)胞質(zhì)，NtCCD4定位在質(zhì)體上。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測表明目的蛋白由4個(gè)α螺旋，30個(gè)β折疊片以及一些無規(guī)則卷曲組成，預(yù)測結(jié)果與玉米VP14蛋白的三維結(jié)構(gòu)相似。qRT-PCR檢測煙草不同組織中NtCCD1和NtCCD4的表達(dá)情況，結(jié)果表明除了NtCCD1B基因，NtCCD1A基因和NtCCD4基因在根、莖、葉和花中均有表達(dá)，NtCCD4在葉中的表達(dá)量最高，其次是花

5、中；NtCCD1A在葉和花中的表達(dá)量比較高，然而NtCCD1B在根中幾乎不表達(dá)。
　?。?）構(gòu)建NtCCD1基因的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)后能夠表達(dá)可溶性的融合蛋白，大小為80KDa左右。在通過基因工程技術(shù)改造能合成番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的菌株中誘導(dǎo)NtCCD1蛋白表達(dá)，與對照比較，菌體的顏色放生了明顯的變化，淺紅色、黃色和淺黃色消失或變淡，說明NtCCD1蛋白能裂解番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素。提取誘導(dǎo)目的基因表達(dá)后合成

6、β-胡蘿卜素的菌體中色素，用HPLC測定峰值，β-胡蘿卜素消失，進(jìn)一步說明了NtCCD1的裂解功能。
　　（3）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化煙草，得到T0代轉(zhuǎn)基因苗，收獲種子并獲得T1代幼苗，通過qRT-PCR驗(yàn)證獲得3株NtCCD1A和5株NtCCD1B轉(zhuǎn)基因苗，測定煙葉中的胡蘿卜素、葉黃素和類胡蘿卜素總含量，與對照相比，超表達(dá)植株中的類胡蘿卜素在個(gè)別植株中顯著下降，但是也有含量顯著升高的植株，說明NtCCD1表達(dá)量會引起體內(nèi)類胡蘿卜