番茄SlCAT2基因的克隆及功能研究.pdf

1、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白在植物體內(nèi)介導了氨基酸的轉(zhuǎn)運,對植物的生長發(fā)育起著極其重要的作用。根據(jù)基因序列的同源性,將植物氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白劃分為兩大家族:ATFs(the amino acid transporter family)和APCs(the amino acid polyamine choline transporter),其中CATs(cationic amino acid transporters)亞家族分屬于APCs家族,植物體內(nèi)對AP

2、C家族成員的研究相對較少,其中主要研究也僅集中于CATs亞家族。
　　本研究從番茄基因組中分離了SlCAT2a與SlCAT2b兩個基因,分析了它們的基因序列特征以及蛋白結構特征,構建了CAT家族蛋白進化樹,對SlCAT2a蛋白進行了亞細胞定位分析,分析了它們在番茄中的時空特異表達模式,構建了SlCAT2a與SlCAT2b基因超表達載體和反義抑制表達載體,轉(zhuǎn)化番茄,并分析了SlCAT2a與SlCAT2b蛋白的底物特異性,初步研究Sl

3、CAT2a與SlCAT2b在番茄生長發(fā)育過程中的生物學功能。主要研究結果如下:
　　1、通過基因序列同源比對,在番茄基因組數(shù)據(jù)庫中找到兩條可能為番茄SlCAT2蛋白的EST序列,分別命名為SlCAT2a、SlCAT2b,比對后發(fā)現(xiàn)從SlCAT2a第474個核苷酸和SlCAT2b第159個核苷酸開始,二者的核苷酸序列完全一樣,僅5’端核苷酸序列存在差異,且SlCAT2a與SlCAT2b均位于10號染色體上,在基因組上的前10個外顯子

4、的位置完全一致。
　　2、采用 RT-PCR技術克隆SlCAT2a、SlCAT2b兩個基因全長片段,SlCAT2a基因全長1950bp,編碼650個氨基酸;SlCAT2b全長1635bp,編碼545個氨基酸。通過生物信息學分析,預測SlCAT2a蛋白有14個跨膜結構域,而SlCAT2b蛋白含有12個跨膜結構域。在CAT蛋白系統(tǒng)進化樹中,SlCAT2a、SlCAT2b與擬南芥AtCAT2、楊樹PtCAT2蛋白同屬于第3亞類,通過Sl

5、CAT2a與GFP蛋白融合亞細胞定位進一步發(fā)現(xiàn)SlCAT2a蛋白位于液泡膜上。
　　3、采用定量 PCR方法,對SlCAT2a、SlCAT2b基因進行時空特異表達模式分析,結果表明SlCAT2a在生殖器官花中的表達量明顯高于其他組織,而SlCAT2b雖在各個組織均有表達,但表達量沒有明顯差異。進一步檢測SlCAT2a、SlCAT2b在花中不同部分的表達特征,結果發(fā)現(xiàn) SlCAT2a在雄蕊中表達量最高,在雄蕊、萼片、花瓣部分均微弱表

6、達,SlCAT2b雖在花的不同部分均有表達,但表達量同樣沒有明顯差異。
　　4、為了研究SlCAT2a、SlCAT2b基因的生物學功能,分別構建了SlCAT2a、SlCAT2b基因超表達載體和AsCAT2反義抑制表達載體,對番茄進行遺傳轉(zhuǎn)化,通過GUS染色、PCR檢測、抗性篩選等多種方法對轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定,并對轉(zhuǎn)基因番茄中SlCAT2a、SlCAT2b的表達量進行了檢測。
　　5、對轉(zhuǎn)基因植株表型進行觀察統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)AsCA