番茄熱誘導型ftsH基因的分子克隆、表達特性及生理功能.pdf

1、FtsH蛋白酶是一種兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侶活性的兼職蛋白，在生物體內具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多為脅迫誘導型：在高等植物中，F(xiàn)tsH蛋白酶與光脅迫、低溫以及病害等密切相關，但對其確切的作用機制尚不清楚。己在多種原核生物中發(fā)現(xiàn)熱誘導的ftsH基因，而在高等植物中尚未見熱誘導ftsH報道。為此，我們構建了熱誘導的番茄cDNA文庫，通過EST分析從中分離出全長的ftsH基因，將其命名為LeftsH6。對其表達特

2、性研究充分證明其熱誘導表達特性；在此基礎上，用反向PCR法克隆了該基因的啟動子，通過凝膠阻滯和GUS表達分析研究該基因的表達調控特征。另外，我們構建了LeftsH6基因的過量、胞質定位(無前導序列的LeftsH6cDNA)和反義的真核表達載體并轉化番茄，獲得了各種轉基因株系，以確定番茄熱誘導型FtsH的生理功能。 主要實驗結果如下：1.從熱誘導的番茄cDNA文庫中分離到全長ftsH基因并進行了特征分析。該基因序列全長2213bp

3、(注冊號：AB217916)，包括一個2019bp的讀碼框，推測的蛋白前體定位到葉綠體中，序列中存在AAA結構域和Zn2+結合結構域等已知的金屬蛋白酶FtsH家族的特征結構域。在已克隆的基因中，該FtsH與擬南芥AtFtsH6最近源，被命名為LeftsH6。利用農桿菌侵染的方法將含有LeftsH6信號肽編碼序列和gfp的融合基因轉化煙草，GFP熒光表達分析發(fā)現(xiàn)：GFP在煙草表皮細胞的葉綠體中表達，證實LeftsH6基因具有葉綠體定位的特

4、性。 體外蛋白酶活性分析表明，純化的FtsH具有蛋白水解活性，能降解酪蛋白但不降解BSA；突變的FtsH(Zn2+結合結構域中的谷氨酸Glu472突變?yōu)楣劝滨０稧ln)失去了體外蛋白酶活性。Southern雜交結果表明，該基因在番茄基因組中是單拷貝；Northern和Western雜交均表明該基因表達被熱誘導，但其表達不被低溫、干旱、鹽脅迫、高光等脅迫調節(jié)。本研究首次證明了高等植物中存在熱誘導的ftsH基因。 2.用反向

5、PCR法從番茄基因組中克隆了LeftsH6基因翻譯起始位點上游1558bp的啟動子序列(注冊號：AB218274)，序列分析表明該啟動子中除含有典型的TATA盒和CAAT盒之外，還含有幾組比較典型的熱激元件(HSE)。利用原核誘導表達的熱激轉錄因子HsfA2和放射性標記的ftsH啟動子片段(包含HSE)進行凝膠阻滯實驗，證實LeftsH6啟動子中的HSE具有與熱激轉錄因子特異結合的能力。 將LeftsH6啟動子1558bp、58

6、7bp和332bp的片段與gus報告基因融合構建真核表達載體(pF1558、pF587、pF332)，轉化煙草。對pF1558轉基因煙草GUS活性檢測表明，該啟動子驅動GUS在熱激的煙草根、葉片和花中高水平表達。各個發(fā)育時期花的子房、柱頭、花藥和萼片，以及成熟花藥的花粉粒均顯示高水平的熱誘導GUS染色。 啟動子缺失分析表明，1558bp的啟動子介導的GUS熱誘導表達是最強的；587bp的啟動子區(qū)域能夠介導GUS的熱誘導表達，但明

7、顯弱于1558bp啟動子；而332bp的啟動子片段驅動的GUS熱誘導表達最弱。 GUS熒光定量分析表明：在轉基因煙草葉片中，熱誘導的GUS熒光活性在40℃達到高峰，與Northern雜交結果一致。在相同的熱激處理條件下，pF1558轉化系顯示出最強的GUS活性，顯著高于pF587和pF332轉化系。實驗結果充分表明，LeftsH6是一個典型的熱激基因，其熱誘導特性是通過LeftsH6啟動子的HSE與熱激轉錄因子的相互作用介導的。

8、 3.將LeftsH6的全長cDNA序列構建到組成型啟動子(CaMV35S)控制的pROK2真核表達載體中，轉化農桿菌LBA4404，通過農桿菌介導的葉圓盤法轉化番茄，獲得了過量表達LeftsH6基因的轉基因番茄，通過Southern雜交證實外源基因已整合入番茄基因組，Northern雜交證實，外源ftsH基因在常溫條件下的番茄轉基因株系中呈現(xiàn)組成型表達，不同的轉基因株系LeftsH6表達信號強度有差別。 過量轉基因番茄

9、營養(yǎng)生長正常，但生殖生長出現(xiàn)障礙。首先表現(xiàn)在花粉高度敗育，不能正常座果。通過RT-PCR/Southern雜交證實了在過量轉基因番茄的花藥中LeftsH6呈現(xiàn)組成型表達；而在未轉基因株中，只有在熱激條件下花藥中才有LeftsH6的表達。LeftsH6基因在番茄花藥中熱誘導表達特性的改變是引發(fā)花粉敗育的根本原因。石蠟切片觀察表明，轉基因番茄的花粉在減數(shù)分裂過程中發(fā)生異常，出現(xiàn)形狀不規(guī)則的小孢子。其次，用未轉基因番茄株的正?；ǚ圻M行人工授粉

10、，能使子房膨大，獲得雜交果實，但雜交果實中的種子嚴重敗育，完全喪失生活力。推測LeFtsH6不僅參與了高溫下的小孢子發(fā)育過程，而且與授粉后的種子發(fā)育過程有關。 4.將LeftsH6基因中編碼信號肽的序列打掉，構建到真核表達載體中轉化番茄，獲得了胞質定位的LeftsH6轉基因番茄。Northern雜交表明，外源基因在胞質定位轉基因番茄中實現(xiàn)組成型表達。胞質定位轉基因番茄能夠正常生長、開花、結實，T1代幼苗耐熱性分析表明與對照株無明

11、顯差異。該結果表明，葉綠體LeFtsH6蛋白酶的正確定位對于其發(fā)揮功能是至關重要的。 5.以LeftsH6基因5'端548bp片段構建反義載體，轉化番茄，獲得了LeftsH6反義株系，通過Northern雜交證明在高溫條件下內源LeftsH6基因的表達明顯被抑制。在正常生長條件下，反義轉基因番茄株與對照株相比，在生長勢、株高、植株形態(tài)、葉形葉色、花序形態(tài)方面均無明顯差異；開花期，通過花粉染色檢查小孢子發(fā)育情況，95％以上花粉渾圓

12、、飽滿、染色深，表明絕大多數(shù)花粉可育，與對照檢查結果一致。反義轉基因番茄能正常座果，并能產生正常、飽滿的種子。 用反義株T3代幼苗進行高溫脅迫處理，表明反義轉基因株比對照株更容易受傷害。對熱激脅迫后的葉綠素熒光特性測定結果表明：反義株與對照株相比，具有更高的初始熒光(Fo)和較低的Fv/Fm(反映PSⅡ光化學效率)，說明反義株遭受更嚴重的傷害，光化學效率下降更顯著，而且更難恢復正常生長。表明反義株系內源LeftsH6表達水平的降

13、低增強了植株對熱脅迫的敏感性。 本論文主要創(chuàng)新點：1.首次從高等植物中克隆了熱誘導的ftsH基因，通過Northern和Western雜交充分證明了其熱誘導表達特性?？寺×藷嵴T導LeftsH6基因1558bp的啟動子序列，證明該啟動子中的HSE與純化的HSF有結合活性。在三種不同長度LeftsH6啟動子(1558bp、587bp、332bp)驅動gus基因表達的轉基因煙草中，1558bp的LeftsH6啟動子驅動的GUS熱誘導表