水稻褐飛虱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的鑒定及克隆.pdf

1、水稻是全世界特別是亞洲人口所必需的糧食作物之一。其蟲(chóng)害控制一直是水稻育種研究的重點(diǎn)，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的不斷發(fā)展，啟動(dòng)子作為基因工程中表達(dá)載體構(gòu)建的重要組成部分也受到重視。它可以調(diào)控基因表達(dá)的位置、時(shí)期與強(qiáng)度。目前，在一些天然的水稻種質(zhì)資源中已經(jīng)克隆或鑒定了一些褐飛虱抗性相關(guān)的基因，利用水稻褐飛虱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，對(duì)一些褐飛虱抗性基因驅(qū)動(dòng)表達(dá)，可以在褐飛虱取食的情況下，有效的提高這些抗性基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，避免其組成型表達(dá)而過(guò)度消耗細(xì)胞內(nèi)

2、的物質(zhì)和能量，可使轉(zhuǎn)基因水稻的抗褐飛虱性能增強(qiáng)，且品質(zhì)和生物安全性得以改善。鑒于上述情況，本研究的目的是分離克隆水稻全基因組中褐飛虱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，使其成為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)育種的有效工具，本研究取得以下結(jié)果:
　　1.以本室李昌焱等褐飛虱接種水稻的芯片數(shù)據(jù)及本實(shí)驗(yàn)室水稻全生育期基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)RT-PCR驗(yàn)證后挑選了8個(gè)在綠色組織特異性表達(dá)，胚乳中不表達(dá)或表達(dá)量低，同時(shí)受褐飛虱取食誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因，利用PCR法以褐飛虱敏感

3、品種TN1或褐飛虱高抗品種RH的基因組為模板分離克隆了這些基因上游的啟動(dòng)子，分別命名為PTG1、PTG2、PTG3、PTG4、 PTG5、PRG1、PRG4、 PRG6。
　　2.將這8個(gè)啟動(dòng)子分別連入DX2181b載體GUS報(bào)告基因上游，并驅(qū)動(dòng)其表達(dá)，將終載體轉(zhuǎn)化至粳稻品種中花11中，PTG5和PRG6在分化中，對(duì)啟動(dòng)子PTG1、PTG2、 PTG3、PTG4、PRG1、PRG4轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)以及拷貝數(shù)檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因

4、陽(yáng)性植株經(jīng)褐飛虱取食及JA處理后，通過(guò)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GUS因的表達(dá)量，找到3個(gè)具有良好應(yīng)用價(jià)值的啟動(dòng)子分別為PTG3、 PRG1、PRG4。
　　3.PTG3的誘導(dǎo)性不受水稻品種基因型限制，受褐飛虱取食最高上調(diào)4.38倍，茉莉酸處理后最高上調(diào)3.17倍;本底表達(dá)量較高，GUS染色變化明顯，為綠色組織特異型啟動(dòng)子。
　　4.PRG1在褐飛虱接種芯片數(shù)據(jù)中，該基因在高抗品種RH中上調(diào)97倍;RT-PCR的基因表達(dá)檢測(cè)中

5、，褐飛虱高抗品種RH中上調(diào)968倍;受褐飛虱危害誘導(dǎo)最高上調(diào)140.50倍，而茉莉酸處理誘導(dǎo)也有輕微上調(diào);本底表達(dá)量低，GUS染色無(wú)變化。
　　5.PRG4誘導(dǎo)性不受水稻品種基因型限制，受褐飛虱取食誘導(dǎo)最高上調(diào)22.08倍，茉莉酸處理誘導(dǎo)最高上調(diào)4.46倍，具有一定組織特異;本底表達(dá)量低，GUS染色變化明顯。
　　綜上所述，利用褐飛虱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以在特定時(shí)期誘導(dǎo)抗褐飛虱基因表達(dá)，對(duì)高效的抗蟲(chóng)、抗病、育種、減少化學(xué)污染以及提