水稻幼苗中受硝酸鹽誘導(dǎo)的相關(guān)基因啟動(dòng)子的克隆.pdf

1、作為轉(zhuǎn)錄水平上一種重要的調(diào)控元件，啟動(dòng)子控制著基因在特定組織、特定發(fā)育階段以及一定環(huán)境條件下表達(dá)。目前，基因功能及調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中精確表達(dá)等方面的研究成為當(dāng)前植物基因工程研究的重點(diǎn)，而這些工作的開展主要依靠一個(gè)合適的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)外在植物基因工程中最常用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子和不同細(xì)胞或器官的特異性啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子使目的基因恒定而持續(xù)表達(dá)，過度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，影響正常代謝；器官特異性啟動(dòng)子雖然可以控制表達(dá)

2、的部位，但不能有效控制基因表達(dá)的時(shí)間和強(qiáng)度。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子則有希望解決這兩個(gè)方面的問題。利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與報(bào)告基因融合，研究基因表達(dá)規(guī)律，進(jìn)一步對(duì)外源基因?qū)崿F(xiàn)定時(shí)、定點(diǎn)、定量的三維調(diào)控表達(dá)，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 研究表明，水稻幼苗在250μmol·L<'-1>-10 mmol·L<'-1>的硝酸鹽溶液中培養(yǎng)時(shí)即可誘導(dǎo)包括硝酸還原酶在內(nèi)的大量蛋白質(zhì)的表達(dá)，在無硝酸鹽的環(huán)境中時(shí)這種誘導(dǎo)作用又逐漸消失。本文對(duì)比分析了水稻(

3、Oryza Sativa)幼苗中受硝酸鹽誘導(dǎo)的基因，選擇了受硝酸鹽誘導(dǎo)表現(xiàn)較強(qiáng)的6個(gè)特異性的基因，克隆出各自基因?qū)?yīng)的5′側(cè)翼序列，并初步鑒定各序列在硝酸鹽誘導(dǎo)下的啟動(dòng)子功能。為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)理，為探討基于硝酸鹽誘導(dǎo)建立理想的“基因開關(guān)”的可行性奠定了基礎(chǔ)。主要研究成果如下： 本研究從水稻幼苗(兩優(yōu)287)中克隆出了6個(gè)可能受硝酸鹽特異誘導(dǎo)的基因的部分cDNA片段。通過半定量PCR鑒定分析，獲得了3個(gè)受硝酸鹽特異誘導(dǎo)的cDN

4、A片段，分別為cNR、cNiR和cGS。進(jìn)一步定位了上述3個(gè)cDNA所對(duì)應(yīng)的基因。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)并通過silicon cloning得到了上述3個(gè)基因的5′調(diào)控區(qū)域。利用PCR進(jìn)行克隆并測(cè)序，序列分析表明3個(gè)序列長(zhǎng)度分別為1187bp，1296bp，1643bp。序列經(jīng)啟動(dòng)子PLACE軟件掃描分析，結(jié)果表明：3組序列中ATG上游、下游鄰近區(qū)域均存在多種啟動(dòng)子的保守元件，如TA-box，CpG島，CAAT-

5、box等。 進(jìn)而，將經(jīng)限制性酶切的上述3個(gè)啟動(dòng)子序列分別克隆到表達(dá)載體pCAMBIAl391Z中報(bào)告基因 gus 的上游，構(gòu)建了新的植物表達(dá)載體 pCAMBIA-pro-NiR、pCAMBIA-pro-NR 和 pCAMBIA-pro-GS。所有載體經(jīng)酶切驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織中，通過瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)了 GUS 的表達(dá)情況，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化 pCAMBIA-pro-GS 的愈傷組織在硝酸