大豆中疫霉誘導(dǎo)性啟動子的克隆與功能研究.pdf

1、由大豆疫霉（Phytophthorasojae）引起的大豆根、莖、苗和種子的腐爛病，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上主要采用種植抗病品種來控制該病害，但傳統(tǒng)育種存在抗病材料的匱乏、育種周期長以及病原菌的快速變異導(dǎo)致的抗病基因時效變短等問題，因此抗病轉(zhuǎn)基因育種將是一種有效的手段，而在轉(zhuǎn)基因過程中，過量表達(dá)目的基因會引起植物的正常生長與發(fā)育，所以利用病原誘導(dǎo)性啟動子是抗病轉(zhuǎn)基因育種的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究利用四個不同大豆

2、品種在大豆疫霉侵染過程中全基因表達(dá)譜的芯片數(shù)據(jù)，篩選了疫霉誘導(dǎo)早期快速上調(diào)表達(dá)的基因，并對其中的三個基因的啟動子進(jìn)行了功能分析，并鑒定了它們的關(guān)鍵調(diào)控元件。主要包括以下研究內(nèi)容:
　　大豆中疲霉誘導(dǎo)性基因的篩選:植物在病原菌侵染時，會調(diào)控許多基因的表達(dá)來參與防衛(wèi)反應(yīng)。根據(jù)已報道的大豆受疫霉侵染的全基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果，通過T測驗和SAM測驗方法，篩選大豆中疫霉誘導(dǎo)表達(dá)基因，初步獲得198個基因EST，并分析對應(yīng)到大豆基因組中180個

3、差異表達(dá)基因。進(jìn)一步尋找這180個基因中上調(diào)表達(dá)更顯著的42個基因，通過qRT-PCR的方法驗證這42個基因，鑒定到了8個在大豆疫霉侵染的初期快速上調(diào)表達(dá)的基因，為進(jìn)一步研究疫霉誘導(dǎo)性啟動子提供了實(shí)驗材料。
　　疫霉誘導(dǎo)性基因GmaPPO12啟動子的研究:根據(jù)疫霉誘導(dǎo)性基因篩選的結(jié)果，克隆了一個大豆多酚氧化酶（GmaPPO12）基因，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)に卣T導(dǎo)不敏感。對啟動子區(qū)（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp）的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該啟動子

4、包含很多已報道的病原誘導(dǎo)性順式元件。該啟動子融合GUS報告基因，在煙草瞬時表達(dá)和大豆根毛穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，均能在大豆疫霉的誘導(dǎo)下快速驅(qū)動報告基因的上調(diào)表達(dá)，且其受誘導(dǎo)強(qiáng)度強(qiáng)于已知的PR1a基因。啟動子的缺失分析最終鑒定到了一個113bp的疫霉誘導(dǎo)片段。全長啟動子及該片段均能驅(qū)動INF1在侵染點(diǎn)引起特異性細(xì)胞死亡。
　　疫霉誘導(dǎo)性基因GmaKSTI20啟動子的功能分析及人工啟動子的構(gòu)建:依據(jù)疫霉誘導(dǎo)性基因篩選的結(jié)果，我們克隆了大豆中一

5、個胰蛋白酶抑制子基因(GmaKSTI20)，該基因啟動子區(qū)包含很多已報道的病原誘導(dǎo)性順式元件。將該啟動子融合GUS報告基因后，能在煙草瞬時表達(dá)和大豆根毛穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中介導(dǎo)疫霉誘導(dǎo)的報告基因表達(dá)，且其受誘導(dǎo)強(qiáng)度強(qiáng)于已報道的PR1a基因。啟動子的缺失分析最終鑒定到了一個受疫霉誘導(dǎo)的122bp的高活性片段。將該片段與前一章鑒定到的113bp活性片段進(jìn)行人工組合，發(fā)現(xiàn)雖然活性依然很高但是相對與單體沒有大幅的提高。進(jìn)一步人工合成該片段的四個重復(fù)單

6、元4XD，發(fā)現(xiàn)能高效的驅(qū)動報告基因的誘導(dǎo)表達(dá)，并且能驅(qū)動INF1在侵染位點(diǎn)特異性細(xì)胞死亡。
　　疫霉誘導(dǎo)性基因GmaDRRP啟動子的功能初探:依照疫霉誘導(dǎo)性基因篩選的結(jié)果，我們克隆了大豆中一個受疫霉誘導(dǎo)表達(dá)的GmaDRRP基因啟動子區(qū)（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1500bp），發(fā)現(xiàn)該區(qū)域也包含很多逆境反應(yīng)相關(guān)順式元件。進(jìn)一步通過煙草瞬時轉(zhuǎn)化和大豆根毛穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系研究該啟動子的功能。結(jié)果表明，GmaDRRP基因啟動子能在不同的轉(zhuǎn)化體系中在疫

7、霉的誘導(dǎo)下驅(qū)動報告基因的表達(dá)。根據(jù)預(yù)測啟動子區(qū)順式元件的位置，做缺失突變，沒有找到活性相對較高的區(qū)域或片段。以上結(jié)果表明，大豆的抗病反應(yīng)蛋白基因GmaDRRP啟動子為疫霉誘導(dǎo)性啟動子。
　　通過上述研究，我們在大豆中獲得了7個疫霉早期誘導(dǎo)性基因;對其中3個基因啟動子進(jìn)行了功能分析，并驗證其為疫霉誘導(dǎo)性啟動子;進(jìn)一步對3個啟動子進(jìn)行缺失突變分析，獲得了2個疫霉誘導(dǎo)性小片段，分別人工組合或合成疫霉誘導(dǎo)性啟動子，獲得了一個高效的疫霉誘導(dǎo)