大豆疫霉效應分子的功能研究.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufman&Gerdman）引起的根腐病是大豆生產上的主要病害之一。大豆疫霉在形態(tài)上同真菌相似，呈絲狀生長，但在進化上與真菌相差甚遠，和藻類進化關系較近，屬于茸鞭生物界、卵茵門．大豆疫霉根腐病每年給全世界大豆生產造成約10-20億美元的經濟損失。大豆疫霉在侵染寄主過程中能夠分泌包括無毒基因在內的大量效應分子，最近研究發(fā)現(xiàn)一類含有RxLR基序的效應分子在卵茵與植物互作中發(fā)揮著重要作用．對

2、大豆疫霉全基因組進行的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其基因組中含有超過350個RxLR類效應分子（Avh, Avirulence homologue）。如此多的效應分子如何在大豆疫霉和寄主互作過程中發(fā)揮作用目前尚不清楚。本文就大豆疫霉部分效應分子對植物防衛(wèi)反應的抑制、效應分子在基因組中的多態(tài)性、效應分子的轉錄特征、功能域，以及部分效應分子在大豆疫霉致病過程中的作用進行了詳細分析。
　　 抑制植物過敏性壞死反應的大豆疫霉效應分子篩選：首先以能

3、夠引起煙草過敏性壞死反應(HR)的細胞凋亡誘導因子Bax、疫霉相關分子特征（PAMP）INF1，以及可直接引起植物HR反應的效應分子Avh238和Avh241作為激發(fā)子，利用農桿菌介導的病毒表達系統(tǒng)在本氏煙上瞬時表達候選的50個Avh效應分子，分析其對上述激發(fā)子誘導的細胞壞死反應的抑制作用。結果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)抑制譜的不同，可以將候選效應分子分為八類。其中，有20個效應分子可以同時抑制Bax、INFI、Avh238和Avh241在本氏煙上產生

4、的HR;有7個效應分子抑制Bax、Avh238和Avh241在本氏煙上產生的HR;有2個效應分子抑制INF1、Avh238、Avh241在本氏煙上產生的HR;7個效應分子抑制Avh238和Avh241在本氏煙上產生的HR;1個效應分子抑制INF1和Avh241在本氏煙上產生的HR;4個效應分子只抑制Avh238;2個效應分子僅抑制Avh241；還有7個對Bax、INF1、Avh238和Avh241在本氏煙上產生的HR均沒有抑制作用。結果

5、表明不同效應分子可能作用于植物防衛(wèi)反應的不同信號途徑。
　　 大豆疫霉效應分子的轉錄特征及序列多態(tài)性分析：為了進一步了解大豆疫霉效應分子在病菌與寄主互作中的作用和面臨寄主的選擇壓力，我們對本研究中篩選的效應分子的轉錄特征和序列多態(tài)性等進行了系統(tǒng)的分析，首先分析了50個效應分子在大豆疫霉轉錄組RNA-seq數(shù)據(jù)庫中RNA積累情況，結果表明，多數(shù)效應分子在大豆疫霉生長發(fā)育、侵染階段均呈現(xiàn)出較高的表達水平；但無法檢測到Avh6、Avh

6、7bl和Avhl41等11個效應分子的轉錄水平；同時對具有不同功能的效應分子進行序列多態(tài)性分析，研究結果并未發(fā)現(xiàn)效應分子抑制植物防衛(wèi)反應的功能與其多態(tài)性之間具有密切的關系，但發(fā)現(xiàn)效應分子的功能與其自身存在的W基序關系密切，即具有抑制植物防衛(wèi)反應功能的效應分子其W基序更易突變或缺失。
　　 能夠誘導植物壞死反應的RxLR類效應分子Avh241功能域分析：在對大豆疫霉效應分子的篩選中，發(fā)現(xiàn)效應分子Avh241可以直接誘導植物的壞死反

7、應，推測其在大豆疫霉與寄主互作過程中可能被植物識別，為了進一步研究植物對該效應分子的識別位點，我們首先對Avh241進行生物信息學分析，結果發(fā)現(xiàn)Avh241具有典型的信號肽區(qū)域、保守的RxLR-dEER結構以及2個W基序和2個Y基序，其編碼的氨基酸序列具有10個a螺旋和1個B折疊的二級結構；基于以上分析對該效應分子進行缺失突變和隨機突變，結果表明：W、Y基序缺失以及B折疊缺失的突變體均不能在本氏煙上產生HR;此外，對具有誘導HR反應的功

8、能片段Avh24159qs8（缺失信號肽和RxLR-dEER基序）進行隨機突變，獲得1300多個突變體，對其進行功能篩選、測序，結果顯示喪失產生HR反應的且發(fā)生點突變的突變體有9個，同時通過Jnet軟件對Avh24159-188進行solvent accessibility預測，結果表明在喪失功能的突變體中的W94、LllO等13個氨基酸位點對于維持正常的蛋白質二級結構具有重要作用，其中，W94和Dis3氨基酸位點對于Avh241發(fā)揮激

9、發(fā)子功能具有重要作用。
　　 大豆疫霉效應分子Avh38和Avh283的功能分析：對抑制植物HR反應的效應分子篩選、不同功能效應分子的轉錄以及序列多態(tài)性分析，結果發(fā)現(xiàn)效應分子Avh38和Avh283具有相同的抑制譜、相似的轉錄模式以及相同的選擇壓力，因此選擇上述效應分子進一步進行功能研究。利用雙鏈RNA介導的基因瞬時沉默技術，對基因Avh38和Avh283進行基因沉默，分別獲得沉默轉化子3個和2個，采用茵絲塊以及游動孢子接種大豆