玉米中組成型雙向啟動(dòng)子的篩選克隆與初步功能鑒定.pdf

1、以玉米為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白具有諸多優(yōu)勢(shì)，玉米是中國(guó)主要糧食作物，產(chǎn)量多、成本低。很多外源蛋白在玉米中需要整株表達(dá)，所以大部分所用啟動(dòng)子都以組成型居多，從目前研究表明，研究人員發(fā)現(xiàn)在人類、微生物、擬南芥、水稻和楊樹的基因組中大量存在雙向基因?qū)Γ窃谟衩字絮r有報(bào)道。而雙向啟動(dòng)子在多基因轉(zhuǎn)化應(yīng)用中具有其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)——因?yàn)閭鹘y(tǒng)啟動(dòng)子一個(gè)啟動(dòng)子只能啟動(dòng)一個(gè)基因，而雙向啟動(dòng)子可以同時(shí)啟動(dòng)兩個(gè)基因。以此在植物表達(dá)載體中想表達(dá)多個(gè)基因時(shí)，可以選擇

2、雙向啟動(dòng)子，這樣可以避免重復(fù)利用啟動(dòng)子而導(dǎo)致的基因沉默等其他結(jié)果。因此本實(shí)驗(yàn)選擇可以組成型表達(dá)的雙向啟動(dòng)子進(jìn)行研究。通過中國(guó)農(nóng)科院的研究人員所建立搜尋模型中研究人員在玉米全基因組中搜尋發(fā)現(xiàn)共有1696個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄本對(duì)，而本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上通過手動(dòng)在線篩選其中600對(duì)雙向轉(zhuǎn)錄本對(duì)，對(duì)比所有雙向轉(zhuǎn)錄本對(duì)的表達(dá)譜，將其中組成型表達(dá)雙向轉(zhuǎn)錄本對(duì)分離出來，一共篩選出9對(duì)組成型表達(dá)雙向轉(zhuǎn)錄本對(duì)。把這些雙向轉(zhuǎn)錄本對(duì)的基因ID（每個(gè)基因在數(shù)據(jù)庫里都有唯一的

3、ID作為編號(hào)）搜索出來，克隆出驅(qū)動(dòng)這些雙向基因?qū)Ρ磉_(dá)的雙向啟動(dòng)子。然后在9個(gè)雙向啟動(dòng)子兩端分別融合GUS和GFP報(bào)告基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，共成功構(gòu)建8個(gè)植物表達(dá)載體，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)鑒定8個(gè)雙向啟動(dòng)子是否有雙向啟動(dòng)功能。
　　主要結(jié)果如下:
　　利用常規(guī)PCR方法克隆已經(jīng)篩選出的8個(gè)玉米組成型表達(dá)雙向啟動(dòng)子序列，通過PlantCare和PLACE在線軟件對(duì)其進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)其每個(gè)啟動(dòng)子除了包含有典型啟動(dòng)子基本順式作用

4、元件之外，還分別含有抗旱誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)，光誘導(dǎo)相關(guān)元件等脅迫誘導(dǎo)順式作用元件。構(gòu)建植物表達(dá)載體，克隆出的8個(gè)雙向啟動(dòng)子為驅(qū)動(dòng)啟動(dòng)子，分別命名為pBD16、pBD23、pBD24、pBD31、pBD34、pBD38、pBD78、pBD80。然后以GUS和GFP基因?yàn)閳?bào)告基因構(gòu)建8個(gè)植物表達(dá)載體，通過三親雜交方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，將8個(gè)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入野生型煙草。轉(zhuǎn)化的煙草經(jīng)GU