Bti75 chi基因調(diào)控元件的鑒定和組成型高效表達(dá)啟動(dòng)子的獲得.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis簡(jiǎn)稱(chēng)Bt）是目前產(chǎn)量最大、使用最廣的生物殺蟲(chóng)劑，至今已有100多年的研究歷史。幾丁質(zhì)含量?jī)H次于纖維素，廣泛存在于甲殼類(lèi)動(dòng)物的外殼、昆蟲(chóng)的甲殼、真菌的胞壁和一些綠藻中。幾丁質(zhì)酶由于能水解幾丁質(zhì)和抑真菌的特性而廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和生物防治領(lǐng)域。目前對(duì)微生物幾丁質(zhì)酶調(diào)控表達(dá)的研究并不多，且主要集中在鏈霉菌。芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶的調(diào)控表達(dá)的研究也僅限在E.coli中的異源表達(dá)調(diào)控

2、。
　　 本研究以蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(B.thuringiensis subsp.israelensis75，簡(jiǎn)稱(chēng)Bti75)為實(shí)驗(yàn)材料。Bti75能產(chǎn)生兩種幾丁質(zhì)酶，ChiA和ChiB。對(duì)幾丁質(zhì)酶基因chiA、chiB上游包含啟動(dòng)子在內(nèi)的調(diào)控序列進(jìn)行系列缺失，與本室構(gòu)建的啟動(dòng)子探測(cè)性載體pCB連接，轉(zhuǎn)化Bti75菌株。pCB上帶有無(wú)啟動(dòng)子的β-半乳糖苷酶基因bgaB作為報(bào)告基因，故插入任一有功能的啟動(dòng)子，則可以在芽胞桿菌

3、細(xì)胞中表達(dá)出β-半乳糖苷酶。通過(guò)酶活性及表達(dá)類(lèi)型的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)chiA調(diào)控序列-123 bp處上游的序列和-10 bp處下游序列對(duì)于chiA基因的表達(dá)與調(diào)控是非必要的;chiA核心啟動(dòng)子(core promoter)位于-123 bp與-42 bp之間，而不是軟件預(yù)測(cè)的-108bp與-59bp之間。在-10bp與-42 bp之間存在一個(gè)應(yīng)答幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的調(diào)控元件——操縱子(operator)，該區(qū)域的堿基部分缺失后，使酶的表達(dá)類(lèi)型變?yōu)榻M成型

4、。本研究發(fā)現(xiàn)chiB調(diào)控序列-324～-253這段區(qū)域不僅是保持chiB基因啟動(dòng)子全效啟動(dòng)效率的5'上限，更是chiB基因啟動(dòng)子能夠行使轉(zhuǎn)錄功能的必要序列。另外還獲得了一個(gè)組成型高效表達(dá)的啟動(dòng)子片段chiBp△M1，該缺失啟動(dòng)子片段在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在的情況下，使表達(dá)的β-半乳糖苷酶比全長(zhǎng)啟動(dòng)子的酶活性提高7倍左右，在工程菌株中，使表達(dá)的幾丁質(zhì)酶活性提高3.5倍左右。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果顯示，啟動(dòng)子效率的變化發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。從3'端缺失至-