香蕉果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子的分離鑒定.pdf

1、啟動(dòng)子是基因5’末端一段與RNA聚合酶相結(jié)合的DNA序列,能夠活化RNA聚合酶,使之與模板序列準(zhǔn)確結(jié)合,啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。在植物上應(yīng)用的啟動(dòng)子按作用方式和功能大致分為三類:組成型啟動(dòng)子,組織特異型啟動(dòng)子,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織特異型啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因在受體植物的特定組織器官中高效表達(dá),果實(shí)特異性啟動(dòng)子作為重要的組織特異性啟動(dòng)子,可以控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)中特異表達(dá)。克隆和研究果實(shí)特異性啟動(dòng)子,可為深入研究果實(shí)品質(zhì)形成、改良果實(shí)品質(zhì)及

2、利用果實(shí)生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)等奠定基礎(chǔ)。
　　 在我們對香蕉果實(shí)發(fā)育與成熟相關(guān)基因研究中發(fā)現(xiàn)二個(gè)果實(shí)特異且大量表達(dá)的基因:香蕉凝集素基因(Banana Lectin Gene,Banlec)和顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因(Granule-Bound Starch Synthase,GBSS)。其中香蕉凝集素基因在前期的研究工作中已經(jīng)分離了它的670bp啟動(dòng)子,研究顯示該啟動(dòng)子具有:果實(shí)特異、大量表達(dá)和ABA誘導(dǎo)等特性。為了深入研究該啟動(dòng)子

3、的功能,研究不同調(diào)控元件對基因表達(dá)的調(diào)控特性,本實(shí)驗(yàn)在670bp啟動(dòng)子基礎(chǔ)上利用Genome Walker方法分離該啟動(dòng)子上游344bp序列,得到總長1014bp的啟動(dòng)子序列,命名為BanLec-1,通過Promoter predictions、PlantCARE等軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)及調(diào)控元件分析,表明在BanLec-1啟動(dòng)子1014bp序列中423-473、556-606和834-884為三處基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū),預(yù)測距離轉(zhuǎn)錄起始密碼子AT

4、G最近的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為A,位于起始密碼子上游111bp處,這與普遍認(rèn)為的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為A相一致。與已知670bp香蕉凝集素基因啟動(dòng)子相比,Banlec-1(1014bp)具有更多的組織特異性表達(dá)調(diào)控元件(CAATBOX1在-648、-548)、低溫抗寒調(diào)控元件(MYCCONSENSUSAT在-690、-684處)、傷害調(diào)控元件(WBOXNTERF3在-871、-743)和ABA等激素應(yīng)答及作用相關(guān)的元件(DPBFCOREDCDC3在-83

5、8,ABRE在-818)。利用該序列置換植物表達(dá)載體pCAMBIA1304上的35S啟動(dòng)子構(gòu)建植物融合表達(dá)載體,然后用基因槍轉(zhuǎn)化香蕉根、葉和果實(shí),GUS基因和GFP基因瞬時(shí)表達(dá)證明,該啟動(dòng)子為果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子,且啟動(dòng)活性高于原有的670bp啟動(dòng)子。
　　 顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因是我們通過果實(shí)抑制差減文庫獲得的,通過基因芯片表達(dá)分析和Northem blot分析,該基因?yàn)楣麑?shí)特異且大量表達(dá),因此我們認(rèn)為該基因的啟動(dòng)子也應(yīng)該是果實(shí)

6、特異且大量表達(dá)的啟動(dòng)子。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因序列設(shè)計(jì)特異引物,利用TAIL-PCR方法分離得到了606bp的基因啟動(dòng)子序列,命名為BR47-1。通過Promoter predictions、PlantCARE等軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)及調(diào)控元件分析,結(jié)果表明在序列中93-138和182-227有兩個(gè)核心啟動(dòng)區(qū)。預(yù)測距離轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG最近的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為C,位于起始密碼子上游420bp處。該序列具有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件:TAT

7、A-box、CAAT-box、G-Box等,TATA-box位于-159、-523、-546和-570等20處;CAAT-box位于-93、-128、-224、-284和-532等10處;G-Box位于-336、-541、-603;此外還含有CCGTCC-box、SORLIP5AT等組織特異性元件,CCGTCC-box位于-283,SORLIP5AT位于-46;脫落酸響應(yīng)的順式作用元件ABRE,分別位于-257、-338和-541處;兩

8、個(gè)與茉莉酸響應(yīng)有關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件CGTCA-motif位于-412處、TGACG-motif位于-656處;兩個(gè)赤霉素應(yīng)答相關(guān)元件P-box位于-84處和TATC-box位于-193處;水楊酸反應(yīng)的順式元件TCA-element位于-549處;兩個(gè)糖相關(guān)的元件CGACGOSAMY3位于-283、WBOXHVISol位于-636和-491。利用該序列置換植物表達(dá)載體pCAMBIA1304上的35S啟動(dòng)子構(gòu)建植物融合表達(dá)載體,然后用基因槍轉(zhuǎn)