早實(shí)枳成花相關(guān)基因啟動(dòng)子的分離與功能鑒定.pdf

1、開(kāi)花是植物生命活動(dòng)過(guò)程中的重要階段,探尋植物開(kāi)花的機(jī)理有助于縮短童期,加速植物育種進(jìn)程。在生物體內(nèi),基因的表達(dá)和調(diào)控是生物體代謝、發(fā)育、生殖等一系列生理活動(dòng)的根本所在。基因的特異性表達(dá)決定了生物體的特異性,啟動(dòng)子是直接調(diào)控基因特異性表達(dá)的重要元件,它決定了基因表達(dá)的強(qiáng)度、時(shí)間和空間等特異性。柑橘LEAFY(LFY)同源基因是促進(jìn)植物成花的基因,TERMIANL FLOWER1(TFL1)同源基因是抑制植物成花因子。研究它們的表達(dá)調(diào)控機(jī)理

2、對(duì)闡明基因功能,探索木本植物成花機(jī)制具有極大的意義。本研究以柑橘早花突變體早實(shí)枳(Precocious Trifoliate Orange)為試驗(yàn)材料,研究了兩個(gè)關(guān)鍵基因PtTFL和PtLFY在早實(shí)枳成花轉(zhuǎn)變過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)及他們的表達(dá)調(diào)控特征,獲得的主要結(jié)論如下:
　　 1.實(shí)時(shí)定量PCR分析了在早實(shí)枳成花轉(zhuǎn)變期PtLFY基因的表達(dá),結(jié)果表明,PtLFY基因的表達(dá)隨著植株生長(zhǎng)發(fā)育而變化,在夏秋季表達(dá)低,12月份表達(dá)開(kāi)始上升,1

3、月份表達(dá)最強(qiáng),并維持至3月份,之后mRNA表達(dá)隨即下降。早實(shí)枳在4月份進(jìn)行花芽分化,這個(gè)變化趨勢(shì)說(shuō)明PtLFY基因與早實(shí)枳的成花轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。
　　 2.從早實(shí)枳和普通枳基因組中分離到PtLFY啟動(dòng)子2185 bp,兩者同源性高達(dá)99％。在線分析軟件表明該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)A(+1),TATA box和CAAT box位于-30 bp和-63 bp,含有6個(gè)赤霉素感應(yīng)元件,2個(gè)脫落酸感應(yīng)元件,5個(gè)光感應(yīng)元件和3個(gè)日照節(jié)律元件。此

4、外,PtLFY啟動(dòng)子還含有兩個(gè)甲基化島,暗示表觀調(diào)控可能也參與了PtLFY基因表達(dá)。
　　 3.將PtLFY:GFP載體(De10)基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞,結(jié)果表明,在洋蔥表皮細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有綠色熒光,能驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)。PtLFY全長(zhǎng)啟動(dòng)子(Del1)轉(zhuǎn)入擬南芥的穩(wěn)定研究結(jié)果顯示,該啟動(dòng)子在擬南芥童期和成年期均有活性,且GUS表達(dá)主要集中在植物的頂端生長(zhǎng)點(diǎn),其活性隨童期年齡的增加而增加,同時(shí)GUS在成年態(tài)植株早期花器官和果實(shí)

5、中也有強(qiáng)烈表達(dá)。
　　 4.構(gòu)建5個(gè)PtLFY5’缺失啟動(dòng)子體,命名為Del2～Del6。除Del6外的缺失啟動(dòng)子都能啟動(dòng)子GUS表達(dá),推測(cè)該啟動(dòng)子的關(guān)鍵元件位于-634～+1 bp。Del2～Del5缺失體均具有頂端分生組織專一性表達(dá)特點(diǎn),也各有特異性。果莢中的表達(dá)僅在Del1和Del2出現(xiàn)；花發(fā)育的早期,僅Del1啟動(dòng)子可在花瓣表達(dá)；在根中的表達(dá)也僅在Del1中出現(xiàn)。各缺失啟動(dòng)子活性大小不一,比較植株25 d時(shí)5個(gè)啟動(dòng)子(D

6、el6除外)活性,Del2活性為Del10.9倍,Del3活性為Del10.67倍,Del4與Del1活性相當(dāng),Del5活性最高,為Del11.2倍。
　　 5.轉(zhuǎn)基因擬南芥用激素及光照處理后,比較Del1啟動(dòng)子在植株生命活動(dòng)中的最大啟動(dòng)子活性,赤霉素處理下Del1增加至1.02倍,脫落酸增加至1.2倍,短日照降低至0.6倍,短日照下赤霉素處理活性為0.8倍。赤霉素處理?xiàng)l件下,與長(zhǎng)日照未處理植株比較Del2～Del5缺失啟動(dòng)子最

7、大活性,Del2增加至1.2倍,Del3增加至1.7倍,Del4增加至1.3倍,Del5增加至1.2倍。將Del1,DeL2和Del5轉(zhuǎn)基因擬南芥用脫落酸處理,在植株25 d時(shí)與對(duì)照比較活性,Del1的活力增加至1.2倍,Del2增加至2.1倍,Del5下降至0.56倍。
　　 6.實(shí)時(shí)定量PCR分析了在早實(shí)枳成花轉(zhuǎn)變期PtTFL基因的表達(dá),結(jié)果表明PtTFL在早實(shí)枳童期表達(dá)較高。在成年態(tài)植株中成花轉(zhuǎn)變到來(lái)前(1月份)表達(dá)量最高

8、,轉(zhuǎn)變期時(shí)表達(dá)量降至最低,在成年態(tài)營(yíng)養(yǎng)器官,如根、莖、葉和花器官、果實(shí)中均有很高表達(dá)。這實(shí)驗(yàn)說(shuō)明早實(shí)枳PtTFL基因維持植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)并抑制植物成花。
　　 7.分離了早實(shí)枳PtTFL啟動(dòng)子1287 bp,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PtTFL啟動(dòng)子TATA box和CAAT box,位于-31bp和-290bp。PtTFL啟動(dòng)子含有2個(gè)赤霉素感應(yīng)元件,2個(gè)光誘導(dǎo)元件和1個(gè)脫落酸類似元件。擬南芥轉(zhuǎn).PtTFL啟動(dòng)子表達(dá)發(fā)現(xiàn),PtTFL啟動(dòng)

9、子在童期的活性隨著植株年齡的增長(zhǎng)而增加,且表達(dá)部位集中在植物生長(zhǎng)點(diǎn)附近,僅在成年態(tài)莖和葉中有表達(dá),花器官不表達(dá)。赤霉素處理對(duì)PtTFL啟動(dòng)子的活性影響復(fù)雜,在成花轉(zhuǎn)變前使啟動(dòng)子活性降低；脫落酸抑制了啟動(dòng)子的活性至0.75倍,短日照處理增加PtTFL啟動(dòng)子活性至對(duì)照1.3倍,短日照下噴施赤霉素使活性增至1.8倍。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,PtTFL啟動(dòng)子受到了赤霉素,脫落酸和日照長(zhǎng)度的廣泛調(diào)控。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)促進(jìn)植物成花的關(guān)鍵基因PtLF