早實(shí)枳FT類似基因的結(jié)構(gòu)分析和功能驗(yàn)證.pdf

1、柑橘在果樹生產(chǎn)中占有重要的地位，但其童期較長，達(dá)6-8年以上，嚴(yán)重阻礙了遺傳育種的進(jìn)展，如何縮短童期受到越來越多的關(guān)注。1976年在湖北宜昌發(fā)現(xiàn)可以在2年內(nèi)開花的枳的變異種—早實(shí)枳，并且它與普通枳一年一次開花不同，在一年內(nèi)可多次成花，這為柑橘育種的研究提供了良好的材料。本實(shí)驗(yàn)室在克隆早實(shí)枳成花關(guān)鍵基因FT時(shí)，得到2個(gè)不同的FTcDNA序列，命名為PtFT1和PtFT2，且又根據(jù)序列的差異人為設(shè)計(jì)了PtFT3及PtFT4。構(gòu)建了4個(gè)PtF

2、T類似基因以及PtFTDNA全長序列在內(nèi)的5個(gè)超表達(dá)載體，在模式植物煙草中異位表達(dá)，以分析早實(shí)枳中FT類似基因的功能及其與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。同時(shí)將PtFT1在柑橘中超量表達(dá)，觀察PtFT1超量表達(dá)對(duì)柑橘造成的影響和表型的變化，為進(jìn)一步研究創(chuàng)造材料。主要結(jié)果如下:
　　 1.不同PtFT類似基因的結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，PtFTDNA序列全長共包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，PtFT1為早實(shí)枳的成熟cDNA序列，有534bp，包括4個(gè)外顯子

3、;在PtFT1擴(kuò)增的同時(shí)，還擴(kuò)增到另一個(gè)序列PtFT2，相比PtFTDNA全長僅缺少了第一個(gè)內(nèi)含子，而相比PtFT1則保留了另外2個(gè)內(nèi)含子;PtFT2在翻譯時(shí)會(huì)在第二個(gè)內(nèi)含子處提前終止，形成PtFT3，因此認(rèn)為發(fā)揮基因功能的主要部位在前2個(gè)外顯子。但有文獻(xiàn)表明FT基因的第四個(gè)外顯子也有重要作用，因此將PtFT3之后的冗余序列單獨(dú)擴(kuò)增，得到PtFT4。
　　 2.分別構(gòu)建了35S::PtFTDNA、35S::PtFT1和35S::

4、PtFT4的超表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因株系，并分別從DNA水平和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了陽性檢測，均證明外源基因已經(jīng)整合到煙草的基因組中。
　　 3.轉(zhuǎn)基因植株表型分析。對(duì)T2代的轉(zhuǎn)基因煙草開花時(shí)間及開花時(shí)葉片數(shù)統(tǒng)詩分析，發(fā)現(xiàn)35S::PtFTDNA，35S::PtFT1和35S::PtFT2樞對(duì)于野生型煙草均有早花效果，可提早開花90-100天，在植株為5cm、葉片4-5片時(shí)開始有花苞形成，而野生型植株花苞形成需要130天、

5、19片葉子。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，上述轉(zhuǎn)基因植株生長過程中有明顯的分枝增多的現(xiàn)象。而35S::PtFT3和35S::PtFT4的轉(zhuǎn)基因煙草在開花時(shí)間及形態(tài)上都與野生型煙草一致，沒有特殊的表型。結(jié)果表明，PtFT基因的第一個(gè)內(nèi)含子可能對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起一定作用，但不影響基因功能的發(fā)揮，但PtFT2中翻譯提前終止的序列以及冗余序列都失去了基因應(yīng)有的功能，說明基因外顯子的完整性是保證基因功能發(fā)揮的前提。
　　 4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，通過抗生素

6、的篩選作用，獲得了普通枳35S::PtFT1轉(zhuǎn)基因植株，分別通過特異引物PCR陽性檢測和RT-PCR分析，證明該基因確實(shí)已經(jīng)整合到普通枳的基因組中。但由于轉(zhuǎn)基因植株尚在生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)或剛移栽到田間不久，表型有待進(jìn)一步觀察。
　　 5.優(yōu)化伏令夏橙遺傳轉(zhuǎn)化體系。為了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)更好地在柑橘中利用，分析了不同種類激素在不同濃度下對(duì)伏令夏橙轉(zhuǎn)化體系的影響，結(jié)果證明適合伏令夏橙芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MT+1.0mg/L6-BA，根誘導(dǎo)的最適