地黃RghBNG基因的結(jié)構(gòu)分析和功能驗(yàn)證.pdf

1、地黃是大宗常用中藥材，是近年來中藥研究的熱點(diǎn)之一，被應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品等多種領(lǐng)域，市場需求量大。目前，地黃和其他植物一樣生活在諸多脅迫因素影響的環(huán)境中，其耐脅迫機(jī)理需深入研究，耐脅迫品種培育的問題亟待解決。另一方面，雖然植物包括地黃的基因及其功能的研究不斷深入，但是，明確具體功能的基因并不太多。地黃耐脅迫基因的研究可為這些問題的研究與解決提供一些基礎(chǔ)與參考。RghBNG基因是我們2013年首次從地黃中克隆的未知功能基因。為了進(jìn)一步

2、研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能，本研究克隆了RghBNG的同源基因和啟動(dòng)子序列，研究了RghBNG的亞細(xì)胞定位，分析了在非生物因素和植物生長調(diào)節(jié)劑下RghBNG基因的表達(dá)。主要結(jié)果如下:
　　1.利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增RghBNG基因的ORF區(qū)，共獲得5個(gè)片段，其中，548bp的片段為RghBNG基因(JX290369)，1974bp的片段為RghBNGL基因。生物信息學(xué)分析表明，該兩條基因序列整體相似性達(dá)21.35％，其局部一致性為9

3、8.83％。RghBNGL基因包含一個(gè)486bp的開放閱讀框(ORF)，編碼161個(gè)氨基酸殘基，但在NCBI中未找到同源氨基酸序列。該基因編碼蛋白的氨基酸相對分子量為18571.8Da，等電點(diǎn)為9.45，編碼帶正電荷堿性蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、不規(guī)則卷曲構(gòu)成，該蛋白沒有信號(hào)肽，為非分泌蛋白。
　　2.用hiTAIL-PCR技術(shù)從懷地黃基因組DNA中克隆得到兩條基因。其中，一條385bp，在植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫P

4、LACE預(yù)測，類似啟動(dòng)子序列，含3處TATAbox，兩處蛋白結(jié)合位點(diǎn)HD-Zip3，1處光反應(yīng)元件CATT-motif，光響應(yīng)要素chs-CMA2a，防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件(TC-richrepeats)、赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、2處胚乳表達(dá)所需的順式調(diào)控元件Skn-1_motif和參與光合作用基因的光調(diào)節(jié)表達(dá)以及葉片特異性表達(dá)的Ⅰ-box，我們初步認(rèn)為本研究克隆的序列可能是RghBNG基因的啟動(dòng)子的某段區(qū)域;另一條578bp，

5、包含一個(gè)390bp的開放閱讀框(ORF)，編碼1條含130個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，與根癌土壤桿菌、土壤桿菌的纖維素合酶基因的同源性達(dá)81％～91％;，其所編碼的氨基酸序列與根癌土壤桿菌、土壤桿菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纖維素合酶基因編碼的氨基酸序列的同源性高達(dá)83％～99％;其推測蛋白質(zhì)具有纖維素合酶的結(jié)構(gòu)域。
　　3.探究NAA、6-BA、赤霉素、汞離子、鉻離子、鹽、溫度、紫外光對地黃基因RghBNG表達(dá)量的影響。利用實(shí)時(shí)熒光定量

6、PCR技術(shù)檢測基因RghBNG在9種誘導(dǎo)因素處理過的地黃根、葉兩個(gè)組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明紫外光照可以誘導(dǎo)RghBNG蛋白在葉中的高表達(dá)量，在Gr6+、赤霉素和鹽的的影響下表達(dá)量次之;在高溫、Hg2+、6-BA的影響下RghBNG的RNA的表達(dá)量與對照相比呈現(xiàn)出被抑制的狀態(tài);在根中，鉻離子誘導(dǎo)RghBNG表達(dá)量最高，赤霉素誘導(dǎo)的表達(dá)量次之，6-BA對其顯示出抑制作用。結(jié)果表明，RghBNG基因的表達(dá)與地黃響應(yīng)非生物和植物生長激素脅迫機(jī)制

7、有關(guān)，耐鉻和鹽脅迫，受赤霉素誘導(dǎo)。
　　4.分別以PstⅠ和HindⅢ作為上下游酶切位點(diǎn)，將RghBNG的ORF片段插入表達(dá)載體pCAMBIAl302，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIAl302-RgBNG-GFP，采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101并轉(zhuǎn)染預(yù)處理的洋蔥表皮，pCAMBIAl302-GFP為對照，進(jìn)行培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，GFP分布在洋蔥細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)，RghBNG分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。