水稻卷葉基因rl-,(t)-的RNAi分析和功能互補(bǔ)驗(yàn)證.pdf

1、水稻適度卷葉是超高產(chǎn)株型育種的重要形態(tài)指標(biāo)之一，其作用已在高產(chǎn)和超高產(chǎn)育種中得到充分的體現(xiàn)。卷葉的形成與葉片的發(fā)育過程密切相關(guān)，水稻作為單子葉模式作物，水稻卷葉基因的功能研究對闡明植物葉片發(fā)育規(guī)律具有重要意義。陳宗祥、邵元健、潘存紅等運(yùn)用圖位克隆法定位了一個卷葉主效基因rl(t)，釋義區(qū)間11kb。本研究在此基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對候選基因進(jìn)行了RNAi分析和功能互補(bǔ)驗(yàn)證。主要結(jié)果如下：
　　 1、通過候選基因分析

2、，對卷葉日本晴進(jìn)行擴(kuò)增和測序，證實(shí)了候選基因的3'UTR存在1個單堿基替換。熒光定量PCR檢測表明：候選基因3'UTR的點(diǎn)突變導(dǎo)致候選基因表達(dá)量的提高，這可能是這個點(diǎn)突變引起mRNA3'端加尾過程的變化而增強(qiáng)了mRNA的穩(wěn)定性，或是減輕了該基因的抑制程度而造成的。
　　 2、通過分別特異的擴(kuò)增rl(t)候選基因中第四、第八外顯子的片段，構(gòu)建了兩個干涉載體rl(t)I-4E、rl(t)I-8E。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻品種日本晴，

3、得到了rl(t)I-4E的T0代植株41株，其中有36株陽性轉(zhuǎn)化子，全部表現(xiàn)為葉片反向近筒狀卷曲；rl(t)I-8E的T0代植株40株，有34株陽性轉(zhuǎn)化子，其中32株表現(xiàn)為葉片反向近筒狀卷曲。以日本晴和rl(t)卷葉日本晴為對照，通過熒光定量PCR檢測的方法，檢測了T0代植株中rl(t)基因的表達(dá)量，結(jié)果表明：卷葉日本晴中rl(t)基因表達(dá)量約為日本晴的1.7倍，T0代植株表達(dá)量為日本晴的1％-30％。
　　 3、本研究通過酶切

4、BAC P0657H12獲得Rl(t)基因全序列，連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300中，構(gòu)建了互補(bǔ)載體pCAMBIA2300-Rl(t)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化卷葉日本晴，得到27個T0代轉(zhuǎn)化子。調(diào)查27個轉(zhuǎn)化子的葉片卷曲度，其中葉片卷曲度大于84％的9株，大于90％的3株(對照卷葉日本晴為65％-75％)，這證明增強(qiáng)Rl(t)基因的表達(dá)就提高了葉片的卷曲度。
　　 本研究基本上完成了候選基因的遺傳轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了候選基因的功能