白菜花粉發(fā)育和授粉受精相關(guān)基因的表達分析與功能驗證.pdf

1、花粉發(fā)育和授粉受精是植物生命周期中的重要環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到蔬菜等農(nóng)作物的產(chǎn)量高低、質(zhì)量好壞、種子多少和品質(zhì)優(yōu)劣等。花粉發(fā)育和授粉受精過程的機制極其復(fù)雜，涉及眾多基因的表達與調(diào)控。目前對這兩個過程的已有研究成果尚不足以全面深入認識該過程。同時從轉(zhuǎn)錄組水平、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及基因表達與功能驗證等三個方面對花粉發(fā)育和授粉受精進行分析，將為認識這兩個相互獨立又緊密聯(lián)系的過程的分子調(diào)控機制提供入口和契機，具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　

2、本文以白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis）‘矮腳黃’核不育（‘Aijiaohuang’genic male sterility, ajhGMS）兩用系‘Bcajh97-01A/B'、‘Polima’核質(zhì)互作不育(polimagenic-cytoplasmic male sterility, polG-CMS)系‘Bcpol97-05

3、A’以及‘Ogura’細胞質(zhì)不育(ogura cytoplasmicmale sterility, oguCMS)系‘Bcogu97-06A’為材料，在通過授粉實驗確定白菜‘矮腳黃’授粉受精過程的不同階段及其所經(jīng)歷的時間的基礎(chǔ)上，采用擬南芥全基因組表達譜芯片(GeneChip(R) ArabidopsisATH1 genome array，ATH1)分析‘Bcajh97-01A’授粉前后雌蕊的轉(zhuǎn)錄組差異;繼而對Bcajh97-01A’授

4、粉前后的雌蕊，以及3個不育系及其共享保持系的花序進行microRNA(miRNA)的表達差異分析，篩選白菜中與花粉發(fā)育及授粉受精相關(guān)的miRNA;隨后，對兩個類果膠酸裂解酶基因Brassicacampestris pectate lyase like9(BcPLL9)、BcPLL10及一個新基因Brassica campestris male fertile21（Bc MF21）進行結(jié)構(gòu)、表達、進化等分析，并采用反義RNA技術(shù)對其分別受

5、抑制后的轉(zhuǎn)基因芽系進行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細胞學(xué)等鑒定，分析其在白菜花粉發(fā)育和授粉受精中的作用機制。取得的主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　 (1)植株形態(tài)和細胞學(xué)觀察結(jié)果表明白菜授粉受精過程可劃分為4個特征時期。以ajhGMS不育株系‘Bcajh97-01A’為母本，可育株系‘Bcajh97-01B'為父本，觀察授粉后，花粉在柱頭萌發(fā)和在花柱中的生長情況。其授粉受精過程表現(xiàn)出4個特征時期，其中時期Ⅰ(0～2 HAP)為花粉粘附、吸水和

6、萌發(fā)，即花粉萌發(fā)期;時期Ⅱ(2～4 HAP)為花粉管在花柱中生長;時期Ⅲ(4～16 HAP)為花粉管在子房中生長，發(fā)生受精，即花粉管生長和受精期;時期Ⅳ(16～24 HAP)為胚胎發(fā)育早期。
　　 (2)通過ATH1芯片分析，比較白菜授粉前后雌蕊轉(zhuǎn)錄組的差異，發(fā)現(xiàn)了77個授粉前后差異表達基因;將其與花粉發(fā)育相關(guān)基因進行比較，發(fā)現(xiàn)了10個花粉發(fā)育和授粉受精持續(xù)表達白菜同源基因。通過擬南芥ATH1芯片分析白菜‘Bcajh97-01A

7、’授粉前后雌蕊轉(zhuǎn)錄組差異，在授粉后雌蕊中檢測到44個上調(diào)表達和33個下調(diào)表達的基因，對它們進行功能分類發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達基因中有20％與細胞壁代謝相關(guān)。通過授粉受精相關(guān)基因與前人報導(dǎo)的花粉發(fā)育相關(guān)基因進行比較，發(fā)現(xiàn)At2g02720等10個基因在花粉發(fā)育和授粉受精過程均表達上調(diào)，表現(xiàn)出持續(xù)表達。并且這10個基因中有7個與細胞壁發(fā)育相關(guān)，其中包含兩個PLL基因(At2g02720，PLL9和At3g01270，PLL10)。
　　 (3

8、)白菜3個雄性不育系與其共同保持系花序的miRNA表達差異分析，表明不同遺傳模式不育系花序miRNA表達具有相似性。利用植物microRNAμParafloTM微流體芯片（miRNA芯片）對白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A’、polG-CMS' Bcpol97-05A’和oguCMS' Bcogu97-06A’及它們共同的保持系‘ Bcajh97-01B’的花序進行miRNA表達的比較分析，在‘Bcajh97-01A’與‘Bca

9、jh97-01B'花序中檢測到屬于7個miRNA家族的差異表達的miRNA為11個;在‘Bcpol97-05A’與‘Bcajh97-01B'花序中檢測到屬于23個miRNA家族的差異表達的miRNA為64個;在‘Bcogu97-06A’與‘Bcajh97-01B'花序中檢測到屬于20個miRNA家族的差異表達的miRNA為70個。其中，在3個不育系中共同下調(diào)表達的miRNA基因家族有1個(miR894)、上調(diào)表達的有2個（miR172和

10、miR399）?！瓸cajh97-01A’和‘Bcpol97-05A’共同下調(diào)和上調(diào)表達miRNA家族分別為1個和4個;‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’共同下調(diào)和上調(diào)的miRNA分別為1個和2個;‘Bcpol97-05A’和‘Bcogu97-06A’共同下調(diào)和共同上調(diào)表達的miRNA分別為8個和7個。這些結(jié)果表明不同遺傳模式不育系花序miRNA表達具有相似性。采用miRNA芯片對白菜‘Bcajh97-01A’授粉前

11、后的雌蕊進行分析，發(fā)現(xiàn)屬于4個miRNA家族的6個miRNA下調(diào)表達，屬于4個miRNA家族的16個miRNA上調(diào)表達。將授粉受精相關(guān)miRNA與花粉發(fā)育相關(guān)miRNA進行比較，發(fā)現(xiàn)有6個miRNA家族（miR896、miR1450、miR172、miRNA168、miR396和miR158）在兩個過程均差異表達。通過對所有檢測獲得的差異表達miRNA進行比較，發(fā)現(xiàn)參與花粉發(fā)育或授粉受精的非冗余miRNA共30個。通過查找已發(fā)表的數(shù)據(jù)發(fā)

12、現(xiàn)，在它們中，有近70％曾被報導(dǎo)在花粉中表達。
　　 (4)通過基因表達和功能分析，發(fā)現(xiàn)花粉和雌蕊特異表達的類果膠酸裂解酶基因BcPLL9與花粉壁內(nèi)壁相關(guān)。采用同源克隆的方法獲得白菜類果膠酸裂解酶基因BcPLL9的cDNA和DNA全長，核酸結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明其具有果膠酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和組織原位雜交分析表明BcPLL9的轉(zhuǎn)錄本在成熟花粉粒、雌蕊的柱頭、花柱上部中表達。采用反義RNA技術(shù)抑制BcPLL9的表達

13、后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的花粉活力部分下降，當花粉體外萌發(fā)時，花粉管生長無力，管壁處于松散的狀態(tài)，不像對照那樣緊貼花粉管質(zhì)膜;花粉管生長長度變短。形態(tài)異常的花粉管比例為44.8％?；ǚ酃荏w內(nèi)萌發(fā)時能穿過柱頭組織，但是到達胚珠的花粉管比例降低，結(jié)籽數(shù)減少。BcPLL9反義RNA轉(zhuǎn)基因植株的成熟花粉粒出現(xiàn)異常的胼胝質(zhì)沉積，萌發(fā)溝部位異常突起，花粉內(nèi)壁缺少清晰的內(nèi)壁內(nèi)層和內(nèi)壁外層結(jié)構(gòu)。
　　 (5)通過基因表達和功能分析，發(fā)現(xiàn)花粉和雌蕊特異

14、表達的類果膠酸裂解酶基因BcPLL10與花粉壁發(fā)育相關(guān)。采用同源克隆的方法獲得白菜類果膠酸裂解酶基因BcPLL10的cDNA和DNA全長，核酸結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明其同樣具有果膠酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和組織原位雜交分析發(fā)現(xiàn)BcPLL10在成熟花粉粒、雌蕊的柱頭、花柱和胚珠中表達;采用反義RNA技術(shù)抑制BcPLL10基因的表達后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的花粉大小、形態(tài)不一，萌發(fā)溝位置異常，含油層外溢并包裹整顆花粉粒，有時導(dǎo)致花粉粘連

15、。萌發(fā)溝處內(nèi)壁外層過度增厚，內(nèi)壁內(nèi)層交薄;非萌發(fā)溝處內(nèi)壁的內(nèi)層和外層結(jié)構(gòu)不明顯。
　　 (6)通過PLL基因家族的結(jié)構(gòu)和進化模式分析，發(fā)現(xiàn)白菜PLL基因在其3個亞基因組上有不同的分布密度，表達模式趨向保守;PLL8、PLL9、 PLL10、PLL11可能是來自基因新功能化或亞功能化。通過對白菜46個PLL基因在其3個亞基因組的分布情況分析發(fā)現(xiàn)有18個位于高密度模塊（lessfractionized, LF）上，分別有16個和12

16、個位于兩個低密度模塊（more fractionized，MF1和MF2）上。這一結(jié)果支持蕓薹屬進化過程中經(jīng)歷兩次四倍化跟隨兩次基因丟失過程的假說。對植物PLL基因的結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)PLL8、PLL9、PLL10、PLL11具有不同于其它PLL的N端保守結(jié)構(gòu)域。對白菜PLL基因的表達分析發(fā)現(xiàn)BcPLL8、BcPLL9、BcPLL10、BcPLL11在花藥和雌蕊中特異表達，推測它們是由其祖先基因新功能化或亞功能化產(chǎn)生。
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17、7)通過基因表達和功能分析，發(fā)現(xiàn)小孢子和絨氈層特異表達的BcMF21在花粉發(fā)育早期發(fā)揮作用。采用同源克隆和RACE-PCR技術(shù)對本實驗室前期經(jīng)cDNA-AFLP分析獲得的差異表達片段（A18T19-4，BBP10/BPO054）克隆獲得基因全長，通過核酸結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其與已知基因同源性很低，可能是一個在花粉發(fā)育早期相關(guān)的新基因，逐按照本實驗室命名與雄性育性相關(guān)的基因系統(tǒng)，命名為Brassica campestris male