白菜花粉發(fā)育和授粉受精相關長鏈非編碼RNA的鑒定方法.pdf

1、花粉形成和授粉受精是種子植物完成有性生殖及世代交替的重要環(huán)節(jié)，與生產(chǎn)上雄性不育系的利用、種子產(chǎn)量的高低與質(zhì)量的優(yōu)劣等息息相關。揭示其分子機理對于從理論上深入理解植物基本生命現(xiàn)象以及在實踐中廣泛開展雜交育種、提高種子產(chǎn)量和質(zhì)量等均具有重要意義。
　　近年來，高通量測序技術的迅猛發(fā)展，使得人們得以從基因組水平上認識和把握以擬南芥和水稻為代表的植物生殖發(fā)育過程。長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，lncRNA）作為

2、在基因組中廣泛存在的一類非編碼分子，已被證明是真核生物調(diào)控基因表達的重要元素，而關于其是否及在多大程度上參與了花粉發(fā)育和授粉受精等生殖發(fā)育過程，目前還鮮有報道。
　　本文在前期獲得的一條與白菜花粉發(fā)育相關的lncRNA——BcMF11的基礎上，試圖對其進行表達和作用機制的進一步研究;同時，為了篩選更多的花粉發(fā)育和授粉受精相關lncRNA，以白菜（Brassica campestrisL.ssp.chinensis Makino，s

3、yn.Brapa ssp.chinensis）‘矮腳黃’核不育(‘Aijiaohuang' genic male sterility，ajhGMS)兩用系‘Bcajh97-01A/B’不同發(fā)育階段的花蕾及授粉后不同時間的雌蕊為材料，通過高通量轉錄組測序(RNA-seq)技術，在全基因組水平上鑒定潛在的白菜lncRNA并對獲得的lncRNA進行了序列、在染色體上的分布、表達等特點的分析;在此基礎上，比較了不育株系（‘Bcajh97-01A

4、’）和可育株系（‘Bcajh97-01B’）Ⅰ～Ⅴ級花蕾中l(wèi)ncRNA的表達差異;分析了授粉受精過程中l(wèi)ncRNA的表達情況;同時，運用生物信息學手段，對獲得的白菜lncRNA進行了是否是miRNA內(nèi)源偽靶基因的模擬以及靶基因的預測及共表達分析;對白菜lncRNA與擬南芥lncRNA的相似性進行了比較和分析;以及根據(jù)靶基因的功能注釋進一步挖掘了在花和花粉發(fā)育過程中起作用的候選lncRNA。取得了如下主要研究結果;
　　(1)對Bc

5、MF11基因的序列進行了克隆，發(fā)現(xiàn)其在白菜、甘藍、黑芥的基因組中均存在多個同源相似序列;利用RT-PCR技術對其在白菜不同組織中的表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)其并非之前研究所認為的那樣在花蕾中特異表達，而是在根中偏向性表達。
　　(2)以ajhGMS‘Bcaj h97-01 A/B’不同發(fā)育階段的花蕾及授粉后不同時間的雌蕊為材料，利用高通量轉錄組測序(RNA-seq)技術，在構建的Unigenes庫的基礎上，進一步利用生物信息學的手段，篩

6、選鑒定出了12051條高度可信的白菜候選lncRNA。利用RT-PCR方法對篩選出的部分lncRNA的表達進行了驗證，兩者的結果基本一致。對這些白菜lncRNA的特點進行分析后發(fā)現(xiàn)，98％以上的白菜lncRNA長度在1000 bp以內(nèi)，在白菜各染色體上均勻分布，盡管lncRNA的表達量均較低，但具有與組織及發(fā)育進程相關的表達特點。
　　(3)對白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’不育株系和可育株系五級花蕾（Ⅰ級花蕾對應于

7、花粉發(fā)育的花粉母細胞時期，Ⅱ級花蕾對應于減數(shù)分裂時期，Ⅲ級花蕾對應于單核花粉期，Ⅳ級花蕾對應于二核花粉期，Ⅴ級花蕾對應于成熟花粉期）中l(wèi)ncRNA的表達分析及同級花蕾表達差異分析發(fā)現(xiàn)，在不育株系‘Bcajh97-01A’的花蕾發(fā)育過程中，Ⅳ級花蕾lncRNA的表達最多，而在Ⅴ級花蕾中特異表達的lncRNA最多;在可育株系‘Bcajh97-01B’的花蕾發(fā)育過程中，在Ⅲ級花蕾中表達的lncRNA最多，而在Ⅴ級花蕾中特異表達的lncRNA最

8、多。綜合五級花蕾的lncRNA表達情況，在可育株系花蕾中表達的lncRNA的總數(shù)比在不育株系花蕾中表達的lncRNA總數(shù)要高;在同級花蕾中，除Ⅳ級外，其余發(fā)育階段的花蕾均表現(xiàn)出可育株系比不育株系具有更多的lncRNA的表達;在可育株系和不育株系的花蕾中也具有共同表達的lncRNA，其中，Ⅰ級花蕾具有最多的共表達lncRNA，共表達最少的是Ⅳ級花蕾。
　　(4)對白菜授粉后不同時間的雌蕊（授粉后1h為花粉在柱頭的萌發(fā)階段，授粉后3h

9、為花粉管在花柱道中的生長階段，授粉后10h為花粉管到達胚珠并受精階段）表達的lncRNA進行分析后發(fā)現(xiàn)，授粉后3h，雌蕊中l(wèi)ncRNA的表達最多;與未授粉對照相比，授粉后1h時部分lncRNA的表達受抑制，表達數(shù)目反而減少。
　　(5)對白菜從花蕾到授粉受精整個發(fā)育過程中l(wèi)ncRNA的持續(xù)表達分析后發(fā)現(xiàn)，從花蕾形成開始到授粉后10h期間，其中約1/10的lncRNA持續(xù)表達，其余大部分為階段性特異表達。
　　(6)利用生物信

10、息學手段，以本實驗室前期獲得的、同樣在ajhGMS‘ Bcajh97-01A/B’花蕾中表達的miRNA為目標，對獲得的白菜lncRNA進行了是否為這些miRNA的內(nèi)源偽靶基因的預測，得到15個可能作為miRNA內(nèi)源偽靶基因的lncRNA。
　　(7)對白菜lncRNA的Trans類靶基因進行預測及其共表達分析，得到904個lncRNA的共6236個Trans類靶基因，其中144個lncRNA與706個靶基因存在共表達關系。