白菜花粉發(fā)育相關(guān)基因BcMF11和BcMF12的克隆、表達(dá)及其功能驗(yàn)證.pdf

1、蕓薹屬(Brassica)作物分布地區(qū)廣。品種資源豐富。也是雜種優(yōu)勢(shì)利用最為普遍的一類作物，發(fā)掘和創(chuàng)建其雄性不育系，用于配制一代雜種，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義?；ǚ郯l(fā)育相關(guān)基因的分離及其功能分析，為深入探索向菜類等蕓薹屬作物花粉發(fā)育的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)有助于通過反義技術(shù)等阻斷與花粉發(fā)育有關(guān)基因的表達(dá)從而獲得雄性不育植株：本研究以白菜(Brassicacampestris L.ssp．chinensis Markino，syn．

2、B．rapa ssp．chinensis)花粉轉(zhuǎn)錄組的分析中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)基因BcMF11(Brassica campestris male fertility gene 11)和BcMF12(Brassica campestris male fertility gene 12)作為研究對(duì)象，采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)擴(kuò)增分離基因全長，分析其序列特征并預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而采剛

3、Northern雜交和RT-PCR(reverse transcriptase polymerasechain reaction)技術(shù)分析它們?cè)诎撞瞬煌l(fā)育階段的營養(yǎng)組織與生殖組織中的表達(dá)狀況，然后依據(jù)反義遺傳學(xué)原理，構(gòu)建組成型啟動(dòng)子CaMV35S(Cauliflower mosaic virus 35S)和白菜絨氈層組織特異型啟動(dòng)子Bc49(Brassica campestrisA9)驅(qū)動(dòng)的反義BcMF11和反義BcMF12基因表達(dá)載

4、體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，從分子、形態(tài)和細(xì)胞學(xué)等方面對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行全面檢測(cè)和分析，明確它們與白菜花粉發(fā)育的關(guān)系，為全面認(rèn)識(shí)花粉發(fā)育的系統(tǒng)性調(diào)控，揭示蕓薹屬作物雄性不育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明： (1)利用RACE技術(shù)從白菜野生型可育株中成功克隆劍花粉特異的BcMFll(DO925484)。該基因eDNA序列全長828 bp，多處出現(xiàn)終止密碼子，缺乏明顯的開放閱讀框，但包含poly(A)尾部結(jié)構(gòu)。堿基組成分析發(fā)現(xiàn)整

5、個(gè)序列中A/T含量較高，達(dá)到58.7％。預(yù)測(cè)的RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能非常低，只有-203.26 kcal·mol<'-1>。BLAST搜索未發(fā)現(xiàn)與其相似的基因。推測(cè)BcMF11是白菜中首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的類似于mRNA的非編碼RNA基因。該基因的上游序列區(qū)存在幾個(gè)與花粉發(fā)育密切相關(guān)的順式作用調(diào)控元件，預(yù)示BcMF11可能與花粉發(fā)育相關(guān)。 Northern雜交與RT-PCR分析表明BcMF11在白菜的花蕾、開放的花及花藥中特異表達(dá)

6、，同時(shí)其轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量隨著花粉的發(fā)育保持緩慢增加，這說明BcMF11屬于在花粉發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)的花粉特異基因。 (2)根據(jù)白菜非編碼RNA基因BcMF11的全長序列設(shè)計(jì)引物，在蕓薹屬植物的10個(gè)物種中PCR擴(kuò)增得到BcMF1的同源序列。序列特征分析發(fā)現(xiàn)，這些BcMF11同源基因具有非編碼RNA的共同特征，說明該非編碼RNA基因在蕓藍(lán)屬植物進(jìn)化過程中核苷酸序列較保守。在序列同源比對(duì)的基礎(chǔ)上，基于Kimura雙參數(shù)(2-parame

7、ter)距離，構(gòu)建BcMF11同源基因在蕓薹屬植物．10個(gè)物種的NJ(Neighbor-joining)系統(tǒng)樹。結(jié)果表明，‘黃芽14’南方大白菜與‘油青’菜心聚為一類，與北方大白菜‘小青口’處于不同的分支，推測(cè)它與北方大白菜有不同的演化過程；而北方大白菜‘小青口’和‘溫州盤菜’蕪菁以極高的支持值聚為一類(BCL值為99％)，成為它們親緣關(guān)系很近的證據(jù)之一。 (3)通過RACE方法從白菜花粉特異cDNA片段BBPl克隆到其全長基因

8、BcMF12(DQ925483)。序列特征分析表明，該基因全長1155bp，最大開放閱讀框894 bp，編碼297個(gè)氨基酸。對(duì)BcMF12編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明它包含60.61％的螺旋和35.69％的環(huán)狀結(jié)構(gòu)?？缒^(qū)及疏水結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白含有6個(gè)保守的疏水跨膜區(qū)。經(jīng)BLAST詢發(fā)現(xiàn)它與植物中已報(bào)道的兒個(gè)跨膜蛋白具有較高的相似性，因此BcMF12可能是白菜中一個(gè)新的跨膜蛋白。 Northern雜交與RT-PCR分析表明Bc

9、MF12主要在白菜野生型可育株的中大蕾和大蕾中表達(dá)，屬于花粉中特異表達(dá)的“晚”基因。 (4)在正確分離反義BcMF11和反義BcMF12片段的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了含有組成型啟動(dòng)子CaMV35S和花藥絨氈層組織特異型啟動(dòng)子BcA9的反義RNA植物表達(dá)載體pBi35S-BcMF11、pB135S-BcMF12、pBIBcA9-BcMF11和pBIBcA9-BcMF12，并通過“凍融法”將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌，根據(jù)已建立的高效白菜類作物遺傳轉(zhuǎn)化

10、體系，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將反義BcMF11和反義BcMF12表達(dá)載體導(dǎo)入菜心(B.campestris ssp．chinensis var．parachinensis Tsen et Lee)中，成功獲得了61個(gè)Kan<'R>(kanamyein-resistant)轉(zhuǎn)基因菜心芽系及305株菜心抗性植株。 (5)對(duì)PCR篩選出的反義BcMF11和反義BcMF12轉(zhuǎn)基因菜心剛性植株進(jìn)行Southern和Northern印跡雜交檢

11、測(cè)，從整合及轉(zhuǎn)錄水平證明反義基因片段已成功轉(zhuǎn)入菜心中，并有效抑制了轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源基因的表達(dá)。x-Gluc組織化學(xué)染色結(jié)果也說明反義BcMF11和反義BcMFl2片段在轉(zhuǎn)基因菜心植株中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 (6)對(duì)BcMF11反義基因菜心轉(zhuǎn)化植株花器官的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其花絲短小，花藥不飽滿，而且部分花藥顏色褐化，花粉數(shù)量極少，甚至無粉。花粉形態(tài)掃描電鏡觀察表明pBl35S-BcMF11和pBIBcA9-BcMF11菜心轉(zhuǎn)基因植株人

12、部分花粉表現(xiàn)畸形，畸形率分別為88.59％和91.26％，極顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昊ǚ鄣幕温?。采用組織化學(xué)方法對(duì)花粉發(fā)育及其形態(tài)的細(xì)胞學(xué)觀察顯示，轉(zhuǎn)基因植株在花粉發(fā)育后期表現(xiàn)為花約癟縮變形，花粉囊萎縮，花粉內(nèi)含物消火，絨氈層細(xì)胞退化，花粉表現(xiàn)敗育。花粉離體萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果顯示，反義pBl35S-BcMF11和反義pBIBcA9-BcMF11轉(zhuǎn)基因植株的花粉萌發(fā)率分別是31.35％和37.24％，均顯著低于對(duì)照植株花粉的萌發(fā)率。由此推測(cè)，

13、BcMF11沉默將使花粉形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯異常，最終導(dǎo)致花粉敗育。 (7)對(duì)反義BcMF12轉(zhuǎn)基因菜心花器官的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其花約不飽滿，顏色發(fā)向，花粉數(shù)量少。電鏡掃描結(jié)果表明，反義pB1BcA9-BcMF12和反義pB135S-BcMF12菜心轉(zhuǎn)基因植株的花粉畸形率相差較大，分別為89.57％和23.42％；相應(yīng)地，其花粉萌發(fā)率分別為38.26％和78.91％，說明BcA9啟動(dòng)子對(duì)反義BcMF12在花粉中表達(dá)的調(diào)控活性較之