豬早期胚胎發(fā)育相關(guān)長鏈非編碼RNA Lnc-370的功能研究.pdf

1、哺乳動物著床前胚胎發(fā)育起始于受精，并伴隨著雌原核及雄原核的遷移和融合，其次是生殖細胞特定遺傳物質(zhì)的降解和合子基因激活(zygote genome activation，ZGA)，并依次完成細胞分裂、致密化及囊胚形成。早期的大多數(shù)早期胚胎發(fā)育相關(guān)研究主要集中在小鼠或非哺乳動物中，往往需要利用其他物種來推測人類早期胚胎發(fā)育進程。豬作為大型哺乳動物，是重要的生物醫(yī)學(xué)模式動物，由于豬的器官大小和人類器官非常相似，豬又可作為重要的器官模型供人類器

2、官移植使用，因而對于豬的生殖調(diào)控研究至關(guān)重要。長非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)曾被認(rèn)為是“暗物質(zhì)”，然而，現(xiàn)在許多研究證實lncRNA參與多種生物進程。lncRNA可以在某些細胞的胞質(zhì)中增強或降低mRNA的穩(wěn)定性以及促進或抑制其翻譯，最終會通過靶向mRNA來影響編碼基因的表達。此外，一些lncRNA可以作為前體或相互作用的短的非編碼RNA的合作伙伴。全基因轉(zhuǎn)錄組研究鑒定出上萬個長非編碼RNA，也

3、發(fā)現(xiàn)有些lncRNA在植入前胚胎發(fā)育(pre-implantation embryonic development，PED)中起著重要的作用。然而，目前已經(jīng)被鑒定出的豬lncRNA依舊很少，且豬lncRNA對于早期胚胎發(fā)育的功能是未知的，目前還沒有相關(guān)研究報道，因此，lncRNA是否參與豬早期胚胎發(fā)育調(diào)控過程值得研究。
　　由于豬ZGA一般發(fā)生在4細胞階段，因此我們針對4細胞時期分析篩選出若干高表達的lncRNA進行了功能解析。在

4、課題組前期的工作中，基于已發(fā)表的RNA-seq數(shù)據(jù)集，大規(guī)模的分析了豬的長鏈基因間非編碼RNA(lincRNA)，從4776個基因位點上鑒定出了7618個新lincRNA，且對篩選出的豬lincRNA進行了模塊構(gòu)建、相關(guān)性分析、聚類分析、功能富集分析等。在本研究中我們又對豬lincRNA進行了結(jié)構(gòu)特征及表達模式分析，結(jié)果表明，豬lincRNA與其他哺乳動物的lincRNA存在許多共同的特性，外顯子數(shù)目少、外顯子長度較長、表達水平低，且存

5、在特定的表達模式。我們選擇篩選出的豬ZGA時期相關(guān)12個lincRNA轉(zhuǎn)錄本進行了Q-PCR驗證，確定其在豬各組織及早期胚胎發(fā)育各時期的表達模式，根據(jù)Q-PCR的結(jié)果可以看出，這些新穎的lncRNA轉(zhuǎn)錄本主要在豬睪丸組織和卵巢組織中高表達，根據(jù)表達模式的不同，我們選擇其中一個轉(zhuǎn)錄本TCONS_00166370作為研究對象，為方便稱呼將這個轉(zhuǎn)錄本命名為Lnc-370，利用鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)干擾方式，進

6、行了Lnc-370功能缺失實驗，發(fā)現(xiàn)LNA干擾片段注射后可以導(dǎo)致豬早期胚胎發(fā)育阻滯在1細胞階段，胚胎無法正常卵裂。隨后，我們探索了Lnc-370干擾后胚胎發(fā)生阻滯的機制，跟蹤了注射組和對照組胚胎的原核形成及核凝集直至分裂的整個過程，結(jié)果顯示Lnc-370干擾后胚胎能夠發(fā)生核膨大且能夠形成原核，但雌雄原核僅僅相互靠近，未發(fā)生融合。同時，利用EdU的免疫熒光染色確定阻滯胚胎能夠發(fā)生DNA復(fù)制，利用γ-H2AX抗體及Annexin-Ⅴ早期凋亡

7、試劑盒檢測到阻滯胚胎伴隨DNA損傷和細胞凋亡。利用α-Tublin抗體對對照組和實驗組胚胎進行紡錘體(Spindle)染色，結(jié)果表明，Lnc-370干擾胚胎不能形成正常的紡錘體形態(tài)，因此我們推測Lnc-370對于紡錘體的組裝可能有重要的調(diào)控作用，也初步探索了一下胚胎阻滯的階段，發(fā)現(xiàn)阻滯胚胎到達不了有絲分裂中期。另外，通過2細胞期單個卵裂球注射LNA的方式對胚胎進行Lnc-370干擾實驗，初步證明Lnc-370被干擾后，胚胎阻滯只特異性的