長(zhǎng)鏈非編碼RNA調(diào)控小鼠卵巢發(fā)育的初步研究.pdf

1、卵巢是雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中重要的器官之一，它的功能主要分為兩大方面，一是作為卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的場(chǎng)所，分化出具有受精能力的卵母細(xì)胞；二是卵巢分泌的性腺激素調(diào)控卵泡發(fā)育和生殖周期等。卵巢活動(dòng)的周期性由多種因素調(diào)節(jié)，如促性腺激素、細(xì)胞因子及核酸分子。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)能在表觀遺傳調(diào)控，轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平，已報(bào)道有很多l(xiāng)ncRNA參與了生物個(gè)體的發(fā)育和疾病的發(fā)生，成為基因研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。卵巢是雌性動(dòng)物機(jī)體

2、生理變化最活躍的器官之一，但目前l(fā)ncRNA參與調(diào)控卵巢發(fā)育的研究鮮有報(bào)道。為了研究lncRNA在卵巢生殖活動(dòng)中的功能，本論文設(shè)計(jì)了四個(gè)連續(xù)實(shí)驗(yàn)，具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。
　　實(shí)驗(yàn)一：探討卵巢中特異性表達(dá)的lncRNA。首先，分析實(shí)驗(yàn)室的lncRNA基因庫，從中篩選出16個(gè)基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)證實(shí)有9個(gè)lncRNA在小鼠多種組織中相對(duì)高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)lncRNA647、lncRNA147和ln

3、cRNA274在卵巢組織中相對(duì)特異性高表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二：不同卵巢狀態(tài)下lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274基因的表達(dá)豐度。分別檢測(cè)了這3個(gè)基因在小鼠不同發(fā)育時(shí)期（5日齡、3周齡、5周齡、8周齡）和發(fā)情周期不同發(fā)情時(shí)期（發(fā)情間期、發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期）卵巢中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA147和 lncRNA274在8周齡小鼠卵巢中的表達(dá)水平最高，在其它3個(gè)發(fā)育階段卵巢中的表達(dá)水平從高到低依次為5日齡

4、卵巢，5周齡卵巢和3周齡卵巢；lncRNA647在5周齡和8周齡卵巢中的表達(dá)水平最高，在其它2個(gè)發(fā)育時(shí)期卵巢中的表達(dá)水平從高到低依次為5天齡卵巢和3周齡卵巢。在發(fā)情周期不同發(fā)情時(shí)期的卵巢中，3個(gè)lncRNA的表達(dá)水平均按照發(fā)情間期、發(fā)情前期，發(fā)情期和發(fā)情后期依次升高，其中在發(fā)情后期中的表達(dá)水平顯著高于其它三個(gè)發(fā)情時(shí)期。
　　實(shí)驗(yàn)三：研究這3個(gè)lncRNA基因在卵巢中特異表達(dá)后對(duì)卵巢功能的影響。構(gòu)建ZP3基因啟動(dòng)子-目的lncRNA

5、基因過表達(dá)質(zhì)粒載體；利用體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法，在8周齡雌鼠右側(cè)卵巢中分別注射lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274載體，左側(cè)卵巢注射ZP3骨架載體（不含目的基因）。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后摘取兩側(cè)卵巢，分別提取卵巢組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)目的基因和卵泡發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平，以及卵巢組織制作石蠟切片并HE染色，觀察并統(tǒng)計(jì)腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中過表達(dá)lncRNA274后，與對(duì)照組相比卵泡發(fā)育相

6、關(guān)基因FSHR的表達(dá)水平升高了約7倍，LHR升高了約18倍，GDF-9升高了約11倍，BMP-15升高了約7.5倍，EGFR升高了約7.5倍；黃體的數(shù)量（13.3±4.9）與對(duì)照組（4.3±0.6）相比顯著增加，而腔前卵泡、有腔卵泡數(shù)量無顯著差異。過表達(dá)lncRNA147后，與對(duì)照組相比FSHR、GDF-9、BMP-15的表達(dá)水平無顯著差異，LHR升高了約4倍，EGFR升高了約5倍；腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量與對(duì)照組相比無顯著差異。

7、過表達(dá)lncRNA647后，F(xiàn)SHR、LHR、GDF-9，BMP-15和EGFR的表達(dá)水平與對(duì)照組相比均無顯著差異；腔前卵泡、有腔卵泡和黃體的數(shù)量與對(duì)照組相比無顯著差異。
　　實(shí)驗(yàn)四：進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA274對(duì)小鼠排卵的作用。構(gòu)建了lncRNA274轉(zhuǎn)基因小鼠。通過小鼠1細(xì)胞胚胎階段制作lncRNA274轉(zhuǎn)基因小鼠，分別獲得F0代和F1代的轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型小鼠，并對(duì)其生育能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10＃-F0代轉(zhuǎn)基因雌鼠產(chǎn)仔

8、數(shù)（10.5±0.6）較同窩野生型小鼠（7.75±1.7）有顯著差異，1＃-F1代和10＃-F1代轉(zhuǎn)基因雌鼠產(chǎn)仔數(shù)（11±1.4，10±1.4）較同窩野生型小鼠（7.5±0.7，6.5±0.7）也均有顯著差異。F0代和F1代轉(zhuǎn)基因小鼠子代與野生型小鼠子代的體重與體長(zhǎng)無明顯差異。
　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3個(gè)在小鼠卵巢中相對(duì)特異性高表達(dá)的lncRNA(lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274)，且它們?cè)?周齡和發(fā)