長鏈非編碼RNA ODRUL調(diào)控骨肉瘤阿霉素耐藥的機制研究.pdf

1、背景：骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，化療是其最重要的輔助療法，然而阿霉素耐藥的出現(xiàn)極大地阻礙了其治療。長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的報道已有很多。尋找與骨肉瘤阿霉素耐藥相關(guān)的lncRNA可能有助于提高臨床的化療敏感性。
　　目的：為了從lncRNA的角度探索骨肉瘤阿霉素耐藥的潛在機制并且深入討論化療耐藥發(fā)生的原因及可能的克服骨肉瘤阿霉素耐藥的潛在策略。
　　方法：采用第三代人類lncR

2、NA-mRNA復(fù)合芯片在三組配對的阿霉素抵抗和敏感的骨肉瘤細(xì)胞(MG63/DXR和MG63)中篩選差異表達的lncRNA和mRNA，隨機選擇15個差異表達的lncRNA（5類）通過qRT-PCR法在細(xì)胞系中檢測其芯片結(jié)果的一致性；通過qRT-PCR法在配對的MG63/DXR和MG63細(xì)胞及另一對配對的阿霉素抵抗和敏感的骨肉瘤細(xì)胞（KH-OS/DXR和KH-OS）、其它阿霉素敏感的骨肉瘤細(xì)胞（U-2 OS和Saos2）中檢測差異表達倍數(shù)最

3、大的3個lncRNA（2個上調(diào)倍數(shù)最大、1個下調(diào)倍數(shù)最大）的表達量；然后我們命名表達上調(diào)倍數(shù)最大的lncRNA-lncRNA ENST00000563280為骨肉瘤阿霉素耐藥相關(guān)上調(diào)lncRNA，即lncRNA ODRUL，并在配對的60例骨肉瘤病人腫瘤組織中通過qRT-PCR的方法檢測lncRNA ODRUL的表達量并與臨床參數(shù)相結(jié)合探索其可能的臨床意義； CCK-8實驗檢測，通過siRNA下調(diào)阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞（MG63/DXR

4、和KH-OS/DXR）中l(wèi)ncRNA ODRUL的表達后，骨肉瘤細(xì)胞對于阿霉素敏感性的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡的改變；Transwell實驗和劃痕實驗分別檢測細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移能力的改變；為進一步探討lncRNA調(diào)控骨肉瘤阿霉素耐藥的分子機制，行生物信息學(xué)分析lncRNA ODRUL與ABCB1、EGFR、ABCC3、IL-6等耐藥相關(guān)基因的表達的相關(guān)性；通過siRNA下調(diào)阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞（MG63/DXR和KH-OS/

5、DXR）中l(wèi)ncRNA ODRUL的表達后，通過PCR和WB實驗分別在RNA和蛋白質(zhì)水平檢測這些基因的表達變化。
　　結(jié)果：通過全基因組的lncRNA-mRNA表達譜分析，我們發(fā)現(xiàn)3465個lncRNA（其中1761個上調(diào)且1704個下調(diào)）和3278個mRNA（其中1607個上調(diào)且1671個下調(diào)）在三組配對的阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞MG63/DXR和配對的阿霉素敏感的骨肉瘤細(xì)胞MG63中差異表達（差異倍數(shù)＞2，P<0.05且錯誤發(fā)現(xiàn)

6、率（FDR）<0.05）；PCR驗證隨機選擇的15個lncRNA的表達差異與芯片結(jié)果全部一致，這說明了芯片平臺的可靠性；同時我們發(fā)現(xiàn)lncRNA ODRUL在阿霉素敏感和抵抗的骨肉瘤細(xì)胞系中表達趨勢始終是一致的，即耐藥株中表達量明顯高于敏感株，在一定程度上說明了其穩(wěn)定性和廣泛性；除此之外，骨肉瘤化療抵抗組腫瘤組織中l(wèi)ncRNA ODRUL的表達明顯高于化療敏感組，且早期肺轉(zhuǎn)移組表達明顯高于非早期肺轉(zhuǎn)移組，同時高表達lncRNA ODRU

7、L的骨肉瘤病人的生存率和生存時間明顯低于低表達組；在MG63/DXR和KH-OS/DXR細(xì)胞中，通過siRNA下調(diào)lncRNA ODRUL的表達后，細(xì)胞對于阿霉素的敏感性均較對照組增強，G1期細(xì)胞比例增加，晚期凋亡細(xì)胞比例增加，同時細(xì)胞侵襲和遷移能力較對照組減弱；另外生物信息學(xué)分析（共表達分析）發(fā)現(xiàn)lncRNA ODRUL與ABCB1、EGFR、ABCC3、IL-6等耐藥相關(guān)基因的表達的相關(guān)性均較高，相關(guān)系數(shù)在0.995以上或者-0.9

8、95以下；在MG63/DXR和KH-OS/DXR細(xì)胞中，通過siRNA下調(diào)lncRNA ODRUL的表達后，PCR和WB實驗結(jié)果顯示只有ABCB1的表達明顯下調(diào)，其余基因的表達無明顯變化，這提示lncRNA ODRUL可能是通過影響經(jīng)典耐藥相關(guān)基因ABCB1的表達來調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的化療抵抗性的。
　　結(jié)論：在本次研究中，我們在配對的阿霉素抵抗的骨肉瘤細(xì)胞MG63/DXR和配對的阿霉素敏感的骨肉瘤細(xì)胞MG63中發(fā)現(xiàn)了眾多差異表達的l