MicroRNA-27a調(diào)控骨肉瘤生物學(xué)行為的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分骨肉瘤細(xì)胞系miRNA表達(dá)譜的分析研究
　　目的：探索miRNA在不同骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)特征及差異，明確骨肉瘤細(xì)胞miRNA的共同表達(dá)譜，并為后續(xù)的機(jī)制研究提供方向指導(dǎo)。
　　方法：收集四種人骨肉瘤細(xì)胞系(U-2OS，Saos-2，MNNG/HOS，MG63)和人成骨細(xì)胞系（hFOB)，提取細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用miRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)行掃描篩查分析，建立骨肉瘤細(xì)胞系的miRNA表達(dá)譜。
　　結(jié)果：應(yīng)用 miR

2、NA表達(dá)譜芯片檢測(cè)四種人骨肉瘤細(xì)胞系(U-2OS，Saos-2，MNNG/HOS，MG63)和人成骨細(xì)胞系(hFOB)之間具有差異性表達(dá)特點(diǎn)的miRNA。我們發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于人成骨細(xì)胞系，在四種人骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)差異達(dá)2倍及以上的miRNA共有27個(gè)，其中表達(dá)水平上調(diào)的miRNA共有23個(gè)（let-7e-5p，miR-20b-5p，miR-92a-3p，miR-125a-5p，miR-196a-5p，miR-214-3p，miR-20a-

3、5p，miR-181a-5p，miR-29b-3p，miR-10b-5p，miR-301a-3p，miR-181d，miR-21-5p，miR-206，miR-7-5p，miR-29a-3p，miR-17-5p，miR-210，miR-25-3p，miR-18a-5p，miR-181c-5p，miR-32-5p，miR-27a-3p），表達(dá)水平下調(diào)的miRNA共有4個(gè)（miR-142-5p，miR-133b，miR-16，miR-144

4、-3p）。
　　結(jié)論：通過 miRNA表達(dá)譜芯片的檢測(cè)與篩選，我們發(fā)現(xiàn)與人成骨細(xì)胞系相對(duì)比，在四種人骨肉瘤細(xì)胞系(U-2OS，Saos-2，MNNG/HOS，MG63)共有27個(gè)miRNA呈差異性表達(dá)的特點(diǎn)。這些具有差異性表達(dá)的miRNA可以為進(jìn)一步研究miRNA在骨肉瘤中的作用與功能提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及方向指導(dǎo)。
　　第二部分miR-27a調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的機(jī)制研究
　　目的：觀察miR-27a對(duì)骨肉

5、瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　方法：利用Lipofectamine?2000將miR-27a inhibitor、miR-27a negative control、miR-27a mimics和miR-27a mimics control轉(zhuǎn)染于骨肉瘤細(xì)胞系。利用Caspase-3、8和9酶活性試劑盒檢測(cè)檢測(cè)Caspase-3、8和9酶活性，流式細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，Transw

6、ell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移侵襲能力，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)骨肉瘤細(xì)胞克隆形成的能力，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞PUMA、BAK和BAX表達(dá)情況。建立裸鼠皮下骨肉瘤瘤模型，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，測(cè)量腫瘤體積以及腫瘤重量，qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)PUMA、BAK和BAX表達(dá)情況。結(jié)果：與其他組相比，miR-27a inhibitor組骨肉瘤細(xì)胞的Caspase-3、9酶活性顯著增加（P

7、<0.01），Caspase-8酶活性也有增加（與無轉(zhuǎn)染組對(duì)比P<0.05），細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P<0.01），增殖明顯受到抑制（P<0.01），遷移顯著減少（P<0.01），細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01），細(xì)胞的克隆形成數(shù)目顯著減少（P<0.01）。miR-27a的表達(dá)水平與PUMA蛋白表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)性，熒光素酶報(bào)告法證實(shí)PUMA基因的3’UTR可以被miR-27a結(jié)合。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-27a inhibi