miR-125b-STAT3反饋調(diào)節(jié)環(huán)路參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及血清microRNA作為骨肉瘤潛在生物標(biāo)志物的研究.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma)是青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，也是骨科學(xué)界治療的難點(diǎn)之一。據(jù)我國(guó)統(tǒng)計(jì)資料顯示，骨肉瘤發(fā)病率在原發(fā)性惡性骨腫瘤中占居首位。該瘤惡性程度甚高，預(yù)后極差，可于數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，截肢后3～5年存活率僅為60％左右。
　　雖然近年來(lái)骨肉瘤在病因、發(fā)生發(fā)展、診斷和治療等方面有了一些進(jìn)展，但進(jìn)展十分緩慢，具體發(fā)病機(jī)制仍然不清楚。其次缺少骨肉瘤診斷和治療的有效靶標(biāo)，進(jìn)一步尋找生物靶標(biāo)，將具有重要的理論和臨床應(yīng)

2、用價(jià)值。同時(shí)如能獲得骨肉瘤血清診斷標(biāo)志物，將對(duì)骨肉瘤的診斷和治療帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。
　　microRNA是一種不編碼蛋白質(zhì)的，約21-25nt大小的單鏈小分子RNA。通過(guò)特異性的結(jié)合靶基因來(lái)調(diào)控其表達(dá)。從1993年，第一個(gè)microRNA:lin-4被發(fā)現(xiàn)后，在過(guò)去的幾十年，大量的microRNA被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為在細(xì)胞的發(fā)生、分化、增殖和凋亡起著重要的作用。近期研究表明，microRNA的表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、預(yù)后相關(guān)。在不

3、同的腫瘤類型中，microRNA呈現(xiàn)兩種不一樣的角色:抑癌基因和癌基因。主要的作用機(jī)制包括:microRNA位點(diǎn)的缺失、擴(kuò)增、突變，表觀遺傳水平改變，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的異常表達(dá)等。值得關(guān)注的是，microRNA具有一個(gè)重要特性，即在血漿和血清中非常穩(wěn)定，不會(huì)被RNA酶降解。這使得其實(shí)際值與病人身上所得的測(cè)試值吻合的很好，如果能在外周血標(biāo)本中找到特異性表達(dá)模式的microRNA生物標(biāo)記物，對(duì)于早期診斷和治療腫瘤具有重大的意義。
　　ST

4、AT3蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在生理狀態(tài)下，STAT3激活快速而短暫，對(duì)于正常細(xì)胞的生理功能起著關(guān)鍵性作用。STAT3是EGFR、IL26/JAK、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道匯聚的焦點(diǎn)，在多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有持續(xù)性過(guò)度激活。STAT3過(guò)度激活后誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因異常高表達(dá)，通過(guò)各種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、阻礙細(xì)胞凋亡。STAT3激活可上調(diào)多種抗調(diào)亡基因(c-myc)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因(cycli

5、n D1/D2)等，通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP、VEGF等表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成。而且STAT3與腫瘤的臨床生物學(xué)行為如腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的耐藥性等相關(guān)。
　　本課題利用microRNA表達(dá)芯片技術(shù)比較了六例骨肉瘤組織標(biāo)本與癌旁組織分化成熟區(qū)域，發(fā)現(xiàn)miR-125b在骨肉瘤病人腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。我們推測(cè)miR-125b在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，即潛在抑癌基因的功能。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明

6、miR-125b能明顯抑制骨肉瘤的增殖，遷移，但作用機(jī)制不明。通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)STAT3的3'UTR有一保守的miR-125b結(jié)合位點(diǎn)，提示STAT3可能為miR-125b的候選下游靶基因。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miR-125b的核心啟動(dòng)區(qū)具有CAAT元件，兩個(gè)STAT3結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)STAT6結(jié)合位點(diǎn)，提示STAT3可以特異性結(jié)合于miR-125b核心啟動(dòng)子區(qū)域。綜上所述，STAT3可以轉(zhuǎn)錄激活miR-125b，同時(shí)STAT3自身受

7、到miR-125b轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控，我們推論STAT3-miR-125b之間可能存在反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。生理狀態(tài)下，細(xì)胞不需要過(guò)多的STAT3，STAT3受miR-125b轉(zhuǎn)錄后抑制;過(guò)多的STAT3可通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活產(chǎn)生更多的miR-125b，抑制STAT3而達(dá)到、維持miR-125b-STAT3間穩(wěn)態(tài)平衡。骨肉瘤細(xì)胞中，STAT3表達(dá)高而miR-125b表達(dá)下降，為什么持續(xù)激活的STAT3不能反饋轉(zhuǎn)錄激活miR-125b?進(jìn)一步分析表明miR-

8、125b啟動(dòng)子具有CpG島，該反饋調(diào)節(jié)環(huán)路可能由于腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)子表觀遺傳調(diào)節(jié)而打斷。本課題通過(guò)兩部分來(lái)研究STAT3-miR-125b反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制以及骨肉瘤患者中血清microRNAs生物標(biāo)記物的篩選。
　　第一部分:miR-125b-STAT3調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制研究:
　　(1) miR-125b-STAT3環(huán)路在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá);
　　(2) miR-

9、125b靶向調(diào)控下游基因:STAT3;
　　(3)STAT3對(duì)miR-125b的轉(zhuǎn)錄激活作用;
　　(4)骨肉瘤細(xì)胞miR-125b啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)。
　　第二部分:血清microRNA作為骨肉瘤生物標(biāo)記物的研究。通過(guò)這些研究，揭示miR-125b-STAT3反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶標(biāo)和可供診斷參考的生物標(biāo)志物，有望為骨肉瘤的臨床診斷和治療提供新的策略和方法。
　　第一部分

10、 miR-125b-STAT3調(diào)節(jié)環(huán)路在骨肉瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制研究
　　第一節(jié) miR-125b-STAT3環(huán)路在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:研究骨肉瘤組織和細(xì)胞系中miR-125b和STAT3的表達(dá)水平。
　　方法:通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法，在骨肉瘤和癌旁組織二組樣品中以及骨肉瘤的三種細(xì)胞系，檢測(cè)miR-125b的表達(dá)水平。其次，通過(guò)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)骨肉瘤組織和細(xì)胞系中ST

11、AT3的蛋白水平。
　　結(jié)果:與癌旁組織相比，骨肉瘤組織中miR-125b水平顯著降低。與HEK-293細(xì)胞系相比，骨肉瘤的三種細(xì)胞系(MG-63，Saos-2，U2-OS)中miR-125b水平顯著降低。與癌旁組織相比，骨肉瘤中STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高;與HEK-293細(xì)胞系相比，骨肉瘤的三種細(xì)胞系(MG-63，Saos-2，U2-OS)中STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著提高。
　　結(jié)論:骨肉瘤組織和骨肉瘤細(xì)胞中，miR

12、-125b表達(dá)水平顯著降低，而STAT3的表達(dá)水平顯著升高。此結(jié)果提示二者可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。
　　第二節(jié) miR-125b靶向調(diào)控下游基因STAT3
　　目的:驗(yàn)證STAT3為miR-125b的下游靶基因。
　　方法:
　　1.我們運(yùn)用Targetscans/PICTAR等靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-125b的下游靶基因可能為STAT3。
　　2.構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體將STAT3的3'UTR區(qū)包

13、含可能與miR-125b結(jié)合的一段序列克隆至pMIR-REPORTER Luciferase vector載體內(nèi)，從而構(gòu)建STAT3野生型（STAT3 WT-luc）熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。而后通過(guò)點(diǎn)突變的方法使STAT3的3'UTR區(qū)包含可能與miR-125b結(jié)合的一段堿基序列發(fā)生突變，構(gòu)建STAT3突變型（STAT3MUT-luc）熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。采取脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將STAT3WT-luc和STAT3MUT-luc與miR-1

14、25b模擬物(miR-125b mimics)和陰性對(duì)照(Negative control)同時(shí)轉(zhuǎn)染到MG-63細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收取細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)采取雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，以海腎熒光素酶(Renilla)作為內(nèi)參，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。最終以二者的比值作為相對(duì)表達(dá)量數(shù)值(Firefly/Renilla)。
　　3.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將不同濃度miR-125b模擬物(miR-125b mimics)轉(zhuǎn)染

15、到Saos-2細(xì)胞內(nèi)，采用蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)檢測(cè)STAT3蛋白表達(dá)水平;CKK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
　　4.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將miR-125b模擬物(miR-125bmimics)、化學(xué)合成并化學(xué)修飾的miR-125b反義核酸(anti—miR-125b)或者陰性對(duì)照(Negative control)轉(zhuǎn)染至MG-63和Saos-2細(xì)胞內(nèi)。收集細(xì)胞后提取總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢

16、測(cè)STAT3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.STAT3為miR-125b的靶基因，miR-125b通過(guò)結(jié)合3'UTR區(qū)抑制靶基因STAT3的表達(dá)。
　　2.miR-125b濃度依賴性的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，過(guò)表達(dá)miR-125b能抑制Saos-2細(xì)胞增殖，抑制STAT3蛋白表達(dá)量。
　　3.轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物的骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表達(dá)量降低。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-125b反

17、義核酸的骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表達(dá)量升高。
　　結(jié)論:STAT3是miR-125b的靶基因，miR-125b通過(guò)結(jié)合STAT3的3'UTR區(qū)抑制靶基因STAT3的表達(dá)。
　　第三節(jié) STAT3對(duì)miR-125b的轉(zhuǎn)錄激活作用
　　目的:探討STAT3作為重要的轉(zhuǎn)錄因子能否轉(zhuǎn)錄激活miR-125b。
　　方法:
　　1.我們首先采取CONSITE和PromoterInspector

18、軟件分析預(yù)測(cè)成熟miR-125b在人基因組上的兩個(gè)基因位點(diǎn)上游的10kb序列，分別是11號(hào)染色體上的miR-125b-1，21號(hào)染色體上的miR-125b-2。找到潛在的啟動(dòng)子區(qū)域。
　　2.構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體將miR-125b-1前體5'端不同長(zhǎng)度片段（-1600 to-900bp，-1400 to-900bp，-1175 to-900bp）序列克隆至PGL3載體。再轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收

19、取細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)采取雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，以海腎熒光素酶(Renilla)作為內(nèi)參，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。最終以二者的比值作為相對(duì)表達(dá)量數(shù)值(Firefly/Renilla)。
　　3.我們選用MatInspector軟件對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析，找出可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　4.采取點(diǎn)突變的辦法使-1175 to-900bp序列中潛在的STAT3結(jié)合序列、STAT6結(jié)合序列和CAAT

20、序列發(fā)生堿基突變，構(gòu)成PGL3-mSTAT3,PGL3-mSTAT6和PGL3-mCAAT突變熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收取細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)采取雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，以海腎熒光素酶(Renilla)作為內(nèi)參，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。最終以二者的比值作為相對(duì)表達(dá)量數(shù)值(Firefly/Renilla)。
　　5.我們通過(guò)凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)來(lái)進(jìn)一

21、步鑒定STAT3蛋白和miR-125b前體上與STAT3蛋白相結(jié)合序列之間的相互作用，首先人工合成STAT3-wt、STAT3-consensus、 STAT3-mut、STAT6-wt寡核苷酸序列探針，其中STAT3-consensus為STAT3所識(shí)別的共有序列作為實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照，再將其中的STAT3-wt和STAT3-consensus用32P同位素標(biāo)記上，根據(jù)不同的探針組合、STAT3抗體與MG-63細(xì)胞核蛋白提取物共孵育，最

22、后根據(jù)DNA-蛋白復(fù)合物的位置、特點(diǎn)和強(qiáng)度來(lái)判斷特異性結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)CONSITE和PromoterInspector軟件我們發(fā)現(xiàn)miR-125b-1有一個(gè)RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子位于miR-125b前體序列上游-1600to-900bp。
　　2.分析不同片段的熒光素酶活性，我們確定核心啟動(dòng)子序列位于-1175 to-900bp區(qū)域。
　　3.通過(guò)MatInspector軟件分析，我們預(yù)測(cè)在其

23、核心啟動(dòng)子區(qū)域具有CAAT元件，兩個(gè)STAT3結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)STAT6結(jié)合位點(diǎn)。
　　4.突變體熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)CAAT元件和STAT3位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變后，熒光素酶活性顯著下降。而STAT6位點(diǎn)突變后，熒光素酶活性無(wú)明顯變化。
　　5.EMSA蛋白-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，[32p]-STAT3-wt探針和MG-63細(xì)胞核蛋白提取物孵育后能被檢測(cè)到DNA-蛋白復(fù)合物的形成。作為陽(yáng)性對(duì)照的[32p]-STAT3-consen

24、sus同樣被檢測(cè)到形成DNA-蛋白復(fù)合物并且遷移到同一個(gè)位置。其次，[32p]-STAT3-wt探針一蛋白復(fù)合物的形成能明顯被STAT3-consensus、未標(biāo)記探針和STAT3抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制，而不會(huì)被堿基序列突變的探針競(jìng)爭(zhēng)抑制。
　　結(jié)論:STAT3蛋白能結(jié)合到miR-125b前體序列的核心啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄激活miR-125b。
　　第四節(jié)骨肉瘤細(xì)胞miR-125b啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)
　　目的:探討骨肉瘤細(xì)胞中miR-1

25、25b啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。
　　方法:選用骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和Saos-2，使用去甲基化藥物5-Aza-2'-deoxycytidine處理細(xì)胞后，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)miR-125b表達(dá)水平的影響。同時(shí)通過(guò)試劑盒提取MG-63和Saos-2中的DNA，再經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鈉的處理，最后通過(guò)甲基化特異性PCR檢測(cè)miR-125b啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.隨著去甲基化藥物5-Aza-

26、2'-deoxycytidine濃度的提高，細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制作用。
　　2.隨著去甲基化藥物5-Aza-2'-deoxycytidine濃度的提高，miR-125b表達(dá)水平明顯升高。
　　3.甲基化特異性PCR檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞miR-125b啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平升高。
　　結(jié)論:骨肉瘤細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平的降低可能與miR-125b啟動(dòng)子區(qū)域DNA的高甲基化相關(guān)。
　　第二部分血清microRN

27、A作為骨肉瘤生物標(biāo)記物的研究
　　目的:篩選出骨肉瘤病人血清標(biāo)本中差異表達(dá)的microRNA，研究其作為診斷骨肉瘤血清標(biāo)記物的潛能。
　　方法:采用microRNA PCR芯片篩選骨肉瘤患者和正常對(duì)照組血清microRNA表達(dá)譜，選擇差異表達(dá)的血清microRNA。將篩選出來(lái)的候選microRNA進(jìn)一步用qRT-PCR在20例腫瘤標(biāo)本和20例正常對(duì)照組驗(yàn)證，ROC分析用來(lái)評(píng)價(jià)其診斷性能。
　　結(jié)果:首先通過(guò)芯片篩選出來(lái)

28、14個(gè)候選microRNA，在此基礎(chǔ)上，擴(kuò)大標(biāo)本量驗(yàn)證，得7個(gè)差異表達(dá)的血清microRNA(miR-106a-5p,miR16-5p, miR-20a-5p, miR-425-5p, miR451a, miR-25-3P,miR139-5p), AUC分別是0.7255(95％ CI0.5435-0.9075),0.7686(95％CI0.6067-0.9306),0.8471(95％ CI0.7155-0.9786),0.7961(