MicroRNA-1178調(diào)控胰腺癌惡性生物學(xué)行為的研究.pdf

1、研究背景:
　　胰腺癌是預(yù)后最差的消化道腫瘤之一，這一方面是由胰腺癌高度惡性的生物學(xué)行為決定，另一方面也與胰腺癌增殖、轉(zhuǎn)移機(jī)制不明確，缺乏有效治療藥物有關(guān)。研究表明STUB1蛋白在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，前期的研究也證實(shí)STUB1可以抑制胰腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。然而STUB1的上游調(diào)控機(jī)制尚不明確，僅有一篇文章報(bào)道在小鼠體內(nèi)miR-764-5p可以調(diào)控STUB1的表達(dá)。因此，在胰腺癌中研究micro RNA(m

2、iRNAs)調(diào)控STUB1的分子機(jī)制，將有望加深對(duì)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的了解。
　　研究目的:
　　探索miR-1178可否在胰腺癌細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)STUB1的表達(dá)。研究miR-1178在胰腺癌中的生物學(xué)功能。明確miR-1178調(diào)控胰腺癌惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制。檢測(cè)胰腺癌組織中miR-1178的表達(dá)水平，評(píng)估其臨床價(jià)值。
　　研究方法:
　　生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)可能調(diào)控STUB1的miRNA;雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)?/p>

3、驗(yàn)驗(yàn)證STUB1是否是miR-1178的靶基因;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA及STUB1mRNA的表達(dá)水平;通過CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期;Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力;免疫印跡(Westem blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平;通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-1178的細(xì)胞株，在裸鼠體內(nèi)觀察miR-1178對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響;采用原位雜交檢測(cè)胰腺癌組織中miR-1178的表達(dá)水平，卡方檢驗(yàn)分析miR-1178

4、的表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性。單因素及多因素生存分析評(píng)估m(xù)iR-1178的預(yù)后價(jià)值。
　　研究結(jié)果:
　　1.靶向調(diào)控STUB1的miRNA預(yù)測(cè)及篩選
　　通過生物信息學(xué)分析提示hsa-miR-4716-3p，hsa-miR-1178，hsa-miR-4690-3p，hsa-miR-556-3p可能是STUB1的潛在上游調(diào)控分子。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明:僅在共轉(zhuǎn)染miR-1178mimics和STUB1野生型mRN

5、A載體時(shí)，螢光素酶活性顯著降低。western blot結(jié)果提示:上調(diào)miR-1178的表達(dá)水平，可以抑制STUB1蛋白的表達(dá)，反之，下調(diào)miR-1178的表達(dá)水平，可以增加STUB1蛋白的表達(dá)。
　　2.MiR-1178對(duì)胰腺癌細(xì)胞惡性表型的調(diào)控作用
　　在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1及BxPC-3中上調(diào)miR-1178的表達(dá)水平可以顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及S期細(xì)胞百分比（P＜0.05）;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達(dá)

6、miR-1178的胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的體積和重量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。反之，可以觀察到相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（P＜0.05）。
　　3.MiR-1178調(diào)控胰腺癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制
　　在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，BxPC-3中過表達(dá)miR-1178時(shí)，EGFR表達(dá)水平增高，AKT的第473位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化水平明顯增高，而總AKT的表達(dá)水平未發(fā)生變化，p21蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。當(dāng)下調(diào)miR-117

7、8時(shí)，可以觀察到相反的結(jié)果（P＜0.05）。過表達(dá)miR-1178時(shí)，SRC的第416位點(diǎn)酪氨酸的磷酸化水平明顯增高，而總SRC的表達(dá)水平未發(fā)生變化，E-Cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯降低。而下調(diào)miR-1178可以觀察到相反的結(jié)果（P＜0.05）。為了驗(yàn)證miR-1178是否通過抑制STUB1表達(dá)，激活了增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的EGFR/AKT/p21與EGFR/SRC/E-cadherin信號(hào)通路，進(jìn)一步在過表達(dá)miR-1178的P

8、ANC-1細(xì)胞株中轉(zhuǎn)入了STUB1基因質(zhì)粒。發(fā)現(xiàn)STUB1可以逆轉(zhuǎn)miR-1178介導(dǎo)的胰腺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且抑制PANC-1細(xì)胞從G1向S期的轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步進(jìn)行western blot分析發(fā)現(xiàn)，STUB1抑制了EGFR/AKT/p21及EGFR/SRC/E-cadherin通路的表達(dá)（P＜0.05）。
　　4.胰腺癌組織中miR-1178的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性
　　胰腺癌組織中miR-1178的表達(dá)水平

9、顯著高于癌旁組織(P＜0.05)。胰腺癌組織中miR-1178表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05）。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)TNM分期、腫瘤分化程度、miR-1178表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)。MiR-1178高表達(dá)的患者的中位生存時(shí)間顯著低于miR-1178低表達(dá)的患者(P=0.014)。多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，TNM高分期(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ)及組織miR-1178高表達(dá)水平是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(分別為P=0.049，HR=1.86

10、6;P=0.025，HR=2.364)。
　　研究結(jié)論:
　　1.MiR-1178可靶向結(jié)合于STUB1mRNA3'-UTR區(qū)域，通過翻譯抑制的方式，下調(diào)STUB1蛋白的表達(dá)。
　　2.MiR-1178可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、加速G1/S期轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲能力，同時(shí)可以增加胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)能力。
　　3.MiR-1178促癌功能的分子機(jī)制為miR-1178通過靶向抑制STUB1表達(dá)，提高了EGF